分子遗传学第三章 DNA的功能课件

1、第三章 DNA的功能第一节 转录 Transcription DNA一般存在于核内，蛋白质合成则在细胞质内，那么DNA是怎样控制蛋白质的合成呢？ 一. RNA是中间体：实验证据用放射性RNA前体（如尿嘧啶）作标记实验表明，最先合成的放射性RNA是在细胞核中产生的；然后用非放射性RNA前体作跟踪实验，结果：放射性RNA又流向了细胞质，这提示，在DNA和蛋白质之间的遗传信息传递过程中，RNA是一中间物。 用非放射性用放射性RNA前体标记 示踪后RNA出现于细胞质中 RNA前体示踪遗传信息的流向中心法则如用T2 噬菌体感染大肠杆菌，最明显的变化是 RNA 的快速合成，而且发现RNA与T2噬菌体的DN

2、A的核苷酸成份是非常相近的。证明 RNA是由DNA合成而来的，然后进入细胞质，在细胞质的特定场所指导合成特定的蛋白质，因此遗传信息的流向包括三个步骤。DNA复制转录 核RNARNA 质转译蛋白质 转录 以DNA为模板，按照碱基互补原则合成一条单链RNA，从而将DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程称转录（transcription），RNA合成以53方向进行。 转录 不对称转录：转录仅发生在DNA的一条链上。分子杂交证明，某一基因的RNA只能与其DNA的一条链有杂交反应，即说明DNA上只有一条链可作为模板合成该基因的RNA。 5 3 变性分开5 3 + 标记的RNA 复性 5 5 5 3 3

3、 3 3 5 模板链（或互补链）编码链 三、转录的起始（Initiation） 1启动子（promoter）：是DNA转录起始信号的一段序列，它能指导全酶与模板正确地结合，并活化酶使之具有起始特异性转录形式。 大肠杆菌启动子序列分三个部位：R位点：RNA聚合酶识别位点；B位点：结合部位；I位点：转录起始部位。 10区 35区 pribnow box TGTTGACA1517bpTATAAT58bp起始点）+1 2RNA聚合酶 E.coli RNA聚合酶500kd，由、五种不同的亚基组成，全酶：2。 核心酶：2； 因子本身无催化功能，当它与核心酶结合时可使RNA聚合酶识别启动子序列，并能特异性地

4、在这些部位上形成稳定的复合体。The early stages of transcription in prokaryotes, showing (a) the components of the process; (b) template binding at the 10 site involving the sigma subunit of RNA polymerase and subsequent initation of RNA synthesis; and (c) chain elongation, after the sigma subunit has dissociated f

5、rom the transcription complex and the enzyme moves along the DNA template.12-8五、转录的终止（Termination） RNA聚合物也能识别链的终止信号。 1在某些情况下，识别作用是直接的。终止子（tenminator）：转录终止的信号，其作用是在DNA模板特异位置处终止RNA的合成。在终止处RNA聚合酶作用停止，新生RNA链释放， 2识别终止信号有时需要某些蛋白质因子（rho因子）的作用，rho因子与RNA聚合酶相互作用导致RNA链释放。终止子（terminator）：DNA序列上转录终止的信号，其作用是在DNA模

6、板的特定位置处终止RNA的合成。DNA上终止子有两个明显特征：如下图（1）链内具有对称结构，能使转录物形成发卡式结构；（2）DNA上有一串A，转录形成的RNA 3端具有多个U，AU配对不牢固，使RNA脱落。 UCC U G G C A U25 C G 15C G G C C G C G 5UAAUCCCACAG CAUUUU 3 535 核糖体ribosomes 是由核糖体蛋白和核糖体RNA（rRNA）组成的复合体。在电镜下，一个核糖体象一个墨滴。有关核糖体的精细的功能仍然是目前众多研究中的重要课题，rRNA分子如何与蛋白质相结合以及其功能目前仍然不清楚。A comparison of the

7、 components in the prokaryotic and eukaryotic ribosome 13-1 二、蛋白质合成 3新的氨基酸通过肽键接到生长的链上： aa3-tRNA3 + aa1-aa2-tRNA2aa1-aa2-aa3-tRNA3 + tRNA2（释放） 较大的多肽 4上述过程继续进行直至aan（最后一个aa连接上) ,整个过程还需mRNA，核糖体，一些蛋白质因子，酶和无机离子。 三、蛋白质合成的特异性1. 识别mRNA上编码特异性氨基酸的密码子是tRNA还是氨基酸?半胱氨酸-tRNA半 丙氨酸tRNA半 用杂合性的丙氨酸tRNA半合成的蛋白在原先预期是半胱氨酸 的

8、位置上都是丙氨酸。 结论：氨基酸在语言上有错误，识别密码子是由tRNA的特异 性决定的。镍化氢2反密码子（anticodon）：tRNA上能识别一个mRNA密码子的位置，这个位置上的碱基与密码子的碱基是互补的。3tRNA的一般结构和功能区由于tRNA上反密码子环能识别mRNA相应的密码子，因此在遗传信息的转译中起十分重要的作用。4tRNA来自何处？一个基因一条多肽的理论并不是完全正确的，有些基因编码蛋白，而另一些基因（如rRNA或tRNA基因）是编码并合成RNA作为终产物。 Holleys two-domensional cloverleaf model of transfer RNA. 13

9、-3A three-dimensional model of transfer RNA. 13-4四、核糖体功能和蛋白质合成 1. 转译组分Elongation of the growing polypeptide chain during translation. 3.延长Termination of the process of translation. 13-84.终止在原核生物中，转译并不等到mRNA合成完成之后开始，一部分mRNA合成后，核糖体能立即附着到mRNA上起动转译，而在真核生物中，转录与转译有时间和空间上的分开。 第三节 遗传密码 The Genetic Code 假如核苷

10、酸对是密码中的字母，字母的不同组合会形成代表不同氨基酸的文字，要解决的问题是：1.密码是重叠还是非重叠的?2.由多少个字母组成一个文字?即密码子3.哪一种特定的密码子或哪几种密码子代表各自特 定的氨基酸? 一、遗传密码的非重叠性 ( nonoverlapping) 11961年，用遗传分析证明，遗传密码是非重叠的实验证据：对TMV由亚硝酸诱发的突变的蛋白作分析表明，在某一蛋白质区段中一次只有一个氨基酸的变化。如果是重叠密码子，那么一个碱基的变化将会使蛋白质中邻近位置上多达三个氨基酸的变化。 A T T G C T C A G C T T G A C A T T T T G T G C G C

11、T C T COverlapping code aa1 aa2 aa3 aa4 aa5 1 2 3 4 5 Nucleic acidNonoverlapping code aa1 aa2 aa3 aa4 aa5Amino acidCodonCodonAmino acid 非重叠密码子和重叠密码子的区别 2在某一特定蛋白质的转译中是以非重叠方式读码的，但并不排除用相应不同的读码框架（reading frames）来编码不同蛋白质的氨基酸的可能性。一种蛋白编码方式 ATT GCT CAG CTT G 另一种蛋白解读时移动一个碱基： A TTG CTC AGC TTG二、密码中字母的数目 理论上推测

12、：至少三个核苷酸对组成一个密码子：43 = 64种 三、利用抑制基因证明密码三联体性质 60年代初，Crick等用遗传学实验验证了密码子的三联体特征： 1原黄素能诱发T4的rII突变（不能在K上生长），其作用是在DNA链中造成单个核苷酸对的插入或缺失： 插AT A TC T A G T C T T A GA T C A G A A T C T G T C T T A G A C A G A T A G A C A A 缺CG A T C T G T T 开始由原黄素诱导的突变体称FCO突变体，FCO再经黄原素处理会自发产生能在E.coli K（）上形成野生型噬菌斑的“回复突变体”（revert

13、ants）。对这些突变体作遗传分析发现，与真正的野生型不同，其回复突变的表型是由于在FCO的同一顺反子中不同位点上发生了第二个突变。这种第二个突变抑制了原先FCO突变的表达 突变抑制基因（Suppressor mutation）：能反作用于或抑制另一突变的效应。（1）抑制基因与它被抑制的那个基因的位置不同；（2）可位于同一基因内，也可位于不同的基因内；（3）不同的抑制基因有不同的功能。 利用重组可以从原初的正向突变体分离到抑制基因突变体。奇怪的是，发现该抑制基因自身也是一种rII突变。 rII(FCO)rIIrII回复rIIrII+ +rIIrII和分离FCO和抑制基因Wild type 怎样

14、解释上述结果？ 原黄素诱导的单个核苷酸对的插入或缺失会引起移码突变（frame-shiit mutation），从而引起大多数密码的错读，但是在某个地方由于插入和缺失的补偿作用，会恢复合适的读码，只在两个突变位点之间产生一小段错误的密码： （用三字母英文单词代表密码子） THE FAT CAT ATE THE BIG RAT 缺C：THE FAT ATA TET HEB IGR AT 插A：THE FAT ATA ATE THE BIG RAT插入恢复了信息中大多数密码的含义，从而抑制了缺失的效应大多数密码的错读大部分恢复合适的读码 假定FCO突变是由于一个核苷酸对的插入，那么第二个突变即抑制

15、基因突变就应该是一个缺失，因为只有这样才能恢复该基因的读码框。假定密码由三字母组成： 野生型：CAT CAT CAT CAT CAT rII 插入A：CAT ACA TCA TCA TCA T 不正确 rIIrII 缺失A： CAT ACA TCT CAT CAT 正确结论 在抑制性基因型中只有少数密码子错误，大部分可恢复原来野生型的密码子，从而产生近乎正常的酶。因此具有类似野生型表型。这与Crick发现的抑制基因突变体表型回恢的遗传事实相符。2符号突变 如果将FCO突变的插入定为“+”，那么抑制基因突变就可自动地定为“”，一个突变与它的抑制因子的符号相反，实验证明：一个“+”不能抑制一个“+

16、”，一个“”也不能抑制一个“”，相同符号的两个突变永远不会相互抑制。 Crick用巧妙的遗传学实验提供了三联体密码学说的第一个证据：*构成“+”或“”的三重突变组合共同作用可以恢复到野生型表型，这一发现说明：遗传密码的单词是由三个连续的核苷酸对组成的。恢复合适的读码进一步图解 ： CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT ACA TAT CAT CAT CAT 正常 * 结论：只有密码子是三联体才会使一个基因内的三个插入或三个缺失自动恢复正确读码,才可以恢复到野生型表型. Deletions 四、遗传密码的兼并性（degeneracy）一个氨基酸具有两个或多个不同的密码子

17、称作密码的兼并性。如果只有20种三联密码有意义，其余44种为无意义，那么大多数移码突变将导致蛋白质合成的终止。小结有关密码的基本知识：（1）密码是非重叠的。（2）密码子是三联体。（3）读码从一固定的起始点开始一直连续不断地读至编码序列的末端，移码突变会改变序列中其余密码子的排列。（4）密码子是兼并的，一个氨基酸不只有一种密码子。第四节 遗传密码的破译Cracking the code遗传密码的破译确定每种三联体的含义，这是过去近四十年来遗传学中最重大的突破之一。一、破译密码的试验1制备单一核苷酸的mRNA。Nurenberg（1961）用大肠杆菌蛋白 质合成的无细胞系统。 Poly U：苯丙氨

18、酸的多肽（UUU）。 CCC：脯，GGG：甘，AAA：赖。2合成含有两种和三种不同核苷酸的mRNA，确定了许多氨基酸的密码子组成，但尚不能确定顺序。如将U和G以3：1掺入合成的mRNA，可得以下结果： 由3/4U和1/4G合成的mRNA中各种密码子的预期频率密码子机率比例 UUU p(UUU)=(3/4)(3/4)(3/4)=27/64 1.00 UUG p(UUG)=(3/4)(3/4)(1/4)=9/64 0.33 UGU p(UGU)=(3/4)(1/4)(3/4)=9/64 0.33 GUU p(GUU)=(1/4)(3/4)(3/4)=9/64 0.33 UGG p(UGG)=(3/

19、4)(1/4)(1/4)=3/64 0.11 GGU p(GGU)=(1/4)(1/4)(3/4)=3/64 0.11 GUG p(GUG)=(1/4)(3/4)(1/4)=3/64 0.11 GGG p(GGG)=(1/4)91/4)(1/4)=1/64 0.03由3/4U和1/4G组成的mRNA转译蛋白质中各种氨基酸的比例氨基酸比例密码子组成苯1.00亮0.37UUUG+2U缬 0.36G+2U半胱 0.35G+2U色0.14U+2G甘0.12U+2G 3三联体结合试验 最终破译密码的试验是三联体结合试验。1964年Nurenberg设计。原理：特定Mini mRNA（三联体）能与特定的t

20、RNA氨基酸和核糖体组成复合体，这种复合体不能通过硝酸纤维滤膜，而未与Mini mRNA结合的tRNA氨基酸能通过滤膜，从而达到检定。 例子与步骤：1. 制备Mini mRNA GUU，加到有E.coli核糖体，各种tRNA及20种氨基酸的合成体系中反应，每次反应中只有一种氨基酸（随意的）是用14C标记的，反应系统经滤膜过滤后，其中只有与核糖体结合的GUU和14C标记的相应于该密码子的氨酰tRNA复合体结合到膜上，其它未与GUU结合的tRNAaa都流走，直至找到GUU结合的标记氨基酸为止。 很快解决了G+2U三种异构三联体的意义：如：GUU将缬氨酰tRNA缬结合到核糖体上，因此，GUU为缬氨酸

21、密码子。同样可测定UUG为亮氨酸密码子，UGU为半胱氨酸密码子。4用三联体多聚体作模板体外合成多肽。如用（UUC）。多核苷酸作模板可按三种方式中的任何一种方式读码：（1）UUC UUC UUC UUC （2）UCU UCU UCU UCU （3）CUU CUU CUU CUU 在无细胞系统中会得到三种肽链，一条是单一苯丙氨酸肽链,一条是单一丝氨酸肽链，再一条是单一亮氨酸肽链，从而缩小了（C+2U）密码子意义的范围。再经三联体结合试验可以很快确定UUC为苯丙氨酸密码子，UCU为丝氨酸密码子，CUU为亮氨酸密码子。二、某些氨基酸会有多个密码子原因主要有二个：1有些氨基酸能被多个不同的tRNA带到核

22、糖体上，不同的tRNA有不同的反密码子。2某些tRNA能将特异的aa带到多种密码子上，因为碱基的配对在密码子的3端和反密码子的5端是不严格的，这种松散的配对学说称摆动学说，反密码子5位的G能与C和U配对，说明一种tRNA（图中携带丝氨酸）能识别UCU和UCC两种密码子。 AG G UCU/C 53mRNA 密码子3 5 反密码子环 密码子反密码子配对摆动原则 反密码子5端 密码子3 G U orCC G onlyA U onlyU A or GI U,C or A 密码子反密码子配对原则三、终止密码子（Stop Codons)定义：并不编码任何aa，为肽链合成终止的信号。1965年，Brenn

23、er等发现终止密码子。将T4噬菌体控制头部蛋白合成的一个顺反子中的6种突变体蛋白的末端与野生型比较，记下每个突变体蛋白末端接下来的那个氨基酸，这6种aa在其密码子的一个核苷酸位置发生变化就会形成UAG，因此UAG是一个终止密码子。野生型 m+Su+ m1Su+（谷酰）CAG m2Su+（赖) AAG m3Su+(谷) GAG m4Su+(酪) UAU UAG m5Su+(色) UGG m6Su+(丝) UCG mSu 多肽长度紧跟突变体蛋白末端接下来的那个氨基酸：UAG终止密码子称为琥珀型密码子（amber codon），由琥珀密码子造成的突变称为琥珀型突变（amber mutation），另

24、二个终止密码子为UGA（乳白型Ocher）。UAA（赭石型ocher）* 终止密码子也称无义密码子（nonsense codons），无义突变是指某一密码子变为终止密码子后造成肽链合成中断的突变，而错义突变（missense mutation）是导致多肽链中单个氨基酸的变化，是一种aa的密码子变为另一aa的密码子的突变。四、无义突变抑制基因 * Nonsense Suppressor Mutations是tRNA反密码子环上发生突变的tRNA基因，它能识别mRNA上的一个无义密码子，因此它能将携带的氨基酸在无义密码子处插入，从而使转译能顺利通过那个无义密码子，而不致造成肽链合成的中止。 酪氨酸

25、反密码子发生突变后能识别终止密码子UAG，UAG的终止作用受到了突变的tRNA抑制后，肽链得以继续延伸。五、起始密码子Start CodonAUG为起始密码子，在mRNA中，通常编码Met，而在大多数原核生物中新的多肽的第一个氨基酸一般为NfMet。携带NfMet的tRNA能起始一条多肽但不能插入到一条生长的链中；携带Met的tRNA能插入到生长的肽链中，但不能起始一条肽链；这二种tRNA具有相同的反密码子，并与密码子AUG互补。小结：遗传信息的贮存、复制、转录和转译在所有的生物中基本上是一致的。 至1966年，全部64种遗传密码破译 第五节 真核生物RNA在真核生物中，RNA的合成和加工在某

26、些方面不同于原核生物 一、RNA合成 在原核生物中，只用单一的RNA聚合酶合成各种类型的RNA；而在真核系统中，有三种不同的RNA聚合酶：（1）RNA聚合酶1合成tRNA；（2）RNA聚合酶II合成mRNA，mRNA是单顺子反子（monocistron），而在原核生物中许多mRNA是多顺反子。（polycistron） ；（3）RNA聚合酶III合成tRNA。二、RNA的加工由细胞核产生的初级RNA转录物在运送到细胞质作转译之前通常要以多种方式进行加工：1在转录物的5端通过三磷酸键结合上一个7甲基鸟 苷，即“戴帽”。 2在3端加一串多聚腺苷，即由polyA组成的尾巴 （150200）。 3剪接，除去RNA转录物的某些内部的插入序列 （intervening seguences）。由细胞核产生的初级RNA转录物在运送到细胞质作转译之前通常要以多种方式进行加工 12-9三、断裂基因 (Split Genes) 1DNA分子上编码蛋白区被一些间隔序列分开，这些间隔序列称为内含子（intron）。Those DNA sequences tha