维生素类药物的分析29-37号课件

1、维生素类药物的分析 概 述维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的 微量营养物资。 人体不能合成维生素。维生素发展史公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来 的维A。1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。1831年-胡萝卜素被发现。1905年-甲状腺肿大被碘治愈。1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。1915年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的1916年-维生素B被分离出来。1917年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是缺乏维D引起的。1920年-发现人体可将胡萝卜转化为维生

2、素A。1922年-维E被发现。1928年-科学家发现维B至少有两种类型。1933年-维E首次用于治疗。1948年-大剂量维C用于治疗炎症。1949年-维B3与维C用于治疗精神分裂症。1954年-自由基与人体老化的关系被揭开。1957年-Q10多酶被发现。1969年-体内超级抗氧化酶被发现。1970年-维C被用于治疗感冒。1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果。第一节 维生素A的分析一、结构与性质（一）结构特征一个共轭多烯侧链的环己烯，有立体异构体R: -H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯 维生素A的分析 相对生物效价维生素A 32

3、5.5 100% 新维生素Aa 328 75%新维生素Ab 320.5 24%新维生素Ac 310.5 15%异维生素Aa 323 21%异维生素Ab 324 24% 或有金属离子存在时氧化3、能与三氯化锑呈色：产生不稳定的蓝色。4、溶解性： 维生素A能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶二、鉴别试验（一）三氯化锑反应 原理：维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。水中水解为氯化氧锑注意：鉴别在无水、无醇条件下进行。VitA去水VitA（VitA3）BP 杂质对照品法 显色剂 三氯化锑USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值三、杂质检查

4、（一）酸值取乙醇与乙醚各15ml，置锥形瓶中，加酚酞指示液5滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至微显粉红色，再加本品2.0g，振摇使溶解，用氢氧化钠滴定（0.1mol/L）滴定，酸值应不大于2.0（中国药典附录H）。（二）过氧化值取维生素A1.0g，加冰醋酸-三氯甲烷（6：4）30ml，振摇使溶解，加碘化钾的饱和溶液1ml，振摇1分钟，加水100ml与淀粉指示液1ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）不得超过1.5ml四、含量测定 含量？(3)(4)(2)(1)荧光法HPLC法Vit A的

5、无水乙醇溶液能产生绿色荧光。可测定血液或动物组织中Vit A含量加SbCl3无水CHCl3溶液，在618620nm波长处有最大吸收，符合Beer定律。SbCl3比色法UV法(三点校正法)（一）UV法立体异构体氧化降解产物合成中间体副产物维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸 三点校正法1、方法建立的依据2、测定原理方法的依据：主成分：在325 328nm有吸收杂质：在310340nm范围内 吸收呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。物质对光的吸收具有加和性。4、杂质吸收(1)维生素A2和维生素A3(2)维生素A的氧化产物环氧化物、维生素A醛和维生素A酸。(3)维生素A在光照下产生的

6、无生物活性的聚合物鲸醇。(4)维生素A的异构体。(5)合成时产生的中间体。 (1)(5)这些杂质在310340 nm波长范围内有吸收，因此，在测定维生素A含量时，必须考虑这些杂质的干扰。三点校正法可以消除这些杂质的影响。5、测定方法 基本步骤:第一步 A的选择 选择依据： 所选A值中杂质的干扰已被基本消除第三步 求效价换算因数由纯品计算而得：第四步：求标示量二、三氯化锑比色法标准曲线法max 618nm620nm优点 简便 快速缺点呈色不稳定 （5 10s内）水分干扰与标准曲线温差1专属性差三氯化锑有腐蚀性维生素B1的分析 维生素B1为白色结晶性粉末，有微弱的特臭，味苦。是抗神经炎的维生素，别

7、名盐酸硫胺（thiamine hydrochloride),广泛存在于谷物如米糠、麸皮 ，蔬菜、牛奶、鸡蛋等中，药用由化学合成制取。中国药典（2010年版)收载有维生素B1及其片剂和注射液。 维生素B1的分析一、结构与性质（一）结构特征维生素B1是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵化合物。本品为氯化4-甲基-3-【（2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基）甲基】-5-（2-羟基乙基）噻唑鎓盐酸盐。结构是为： 氨基嘧啶环噻唑环UV氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱)（二)理化性质1.溶解性维生素B1为盐酸盐，易溶于水，微溶于乙醇，在乙醚中不溶。2.硫色素反应分子中的噻唑环在碱性介质中开环，再与嘧啶

8、环上的氨基环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成有荧光的硫色素，溶于正丁醇呈蓝色荧光。可用于鉴别和含量测定。3. 紫外特征吸收分子中的芳香杂环结构具有紫外吸收，可用于含量测定。4.与生物碱沉淀试剂反应分子中含有嘧啶环和噻唑环两个含氮杂环，可与碘化汞钾碘溶液硅钨酸等生物碱沉淀试剂反应生成组成恒定的沉淀，用于鉴别和含量测定。5.氯化物的特性维生素B1为盐酸盐，其水溶液显氯化物的鉴别反应。6.硫化物特性分子中的硫原子在热强碱液中分解成硫化物，与硝酸铝反应生成硫化铅黑色沉淀。二、维生素B1的鉴别（一）硫色素反应维生素B1分子结构中的噻唑环在碱性介质中开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化生成具有

9、荧光的硫色素，在正丁醇（或异丁醇等）中显蓝色荧光。荧光消失正丁醇蓝色荧光H+OHNaOHH2O环合O2H硫色素Thiochtome（二）沉淀反应 维生素B1结构中有氮杂环，可与生物碱沉淀剂反应生成沉淀。如与碘化汞钾反应生成淡黄色沉淀、与碘反应生成红色沉淀、与硅钨酸反应生成白色沉淀等，均可用于维生素B1的鉴别。 VitB1H+（三）氯化物反应 本品为盐酸盐，可用氯化物的反应鉴别。 （四）硫元素的反应本品分子结构中含硫元素，与NaoH共热产生硫化钠，再与硝酸铅反应呈黑色沉淀，可供鉴别。（五）红外分光光度法中国药典（2010版）收载的维生素B1及其制剂均采用红外分光光度法鉴别三、杂质的检查维生素B1

10、的合成工艺表明，其合成步骤多，工艺中可能引入的杂质也比较多， 中国药典（2010版）采用HPLC法检查有关物质，以控制杂质的量。1.酸度 取本品0.50g，加水20mL溶解后，依法测定（中国药典）附录VIH），PH应为2.8-3.32.溶液的澄清度与颜色 取本品0.1g，加水10mL溶解后，溶液应澄清无色;如显色，与对照液（取比色用重铬酸钾液0.1mL，加水适量使成10mL）比较，不得更深。3.硫酸盐 取本品2.0g，依法检查（中国药典附录B），与标准硫酸钾溶液2.0mL制成的对照液比较，不得更深（0.01%）4.硝酸盐 取本品0.1g，加水溶解并稀释至100mL，取0.1mL，加水4.0mL

11、与10%氯化钠溶液0.5mL，摇匀，精密加稀靛胭脂试液【取靛胭脂试液，加等量的水稀释。临用前，量取本液1.0mL，用水稀释至50mL，照紫外-可见分光光度法（中国药典）附录A),在610nm的波长处测定，吸光度应为0.3-0.4】1mL，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸5.0mL，立即缓缓振摇1分钟，放置10分钟，与标准硝酸钾溶液（精密称取在105干燥至恒重的硝酸钾81.5mg，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。每1mL相当于50ug的NO3-0.50mL用同一方法制成的对照液比较，不得更深（0.25%）。5.有关物质 取本品，精密称

12、定，用流动相溶解并稀释制成每1mL中约含1.0Mg的溶液作为供试品溶液；精密量取1mL，置100mL量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照液。照高效液相色谱（中国药典D）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-0.02moL/L庚烷磺酸钠溶液（含1%三乙胺，用磷酸调节PH至5.5）（9:9:82)为流动相，检测波长为254nm，理论板数按维生素B1峰计算不低于2000，维生素B1峰与前后峰的分离度均应符合要求。取对照溶液20uL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。再精密量取供试品溶液与对照品液各20uL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主

13、成峰保留时间3倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照品溶液主峰面积的0.5倍（0.5%）。6.干燥失重 取本品，在105 干燥至恒温，减失重量不得过5.0% （中国药典附录L)。7.炽灼残渣 不得过0.1% （中国药典附录N）。 8.铁盐 取本品1.0g，加水25ml稀释后，依法检查（中国药典附录G），与标准铁溶液2.0mL制成的对照液比较，不得更深（0.002%）。9. 重金属 取本品1.0g，加水25ml稀释后，依法检查（中国药典附录H第一法），含重金属不得过百万分之一。10.总氯量 取本品约0.2g，精密称定，加水20ml溶解后，加稀醋酸2ml与溴酚蓝指示液8-1

14、0滴，用硝酸银滴定液（0.1moL/L）滴定至蓝紫色。每1ml硝酸银滴定液（0.1moL/L）相当于3.54mg的氯。按干燥品计算，含总氯量应为20.6%-21.2%。四、含量 测定 维生素B1及其制剂常用的含量测定方法有非水溶液滴定法、紫外分光光度法、硫色素银光法和硅钨酸重量法。中国药典中原料药采用非水溶液滴定法，片剂及注射液采用紫外分光光度法测定含量。 （一）非水溶液滴定法 1.原理：含有两个碱性的已成盐的伯胺和季铵基团在非水溶液中可与高氯酸作用，用于含量测定。喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）2、方法： 用冰醋酸作溶剂，滴加醋酸汞， 以喹哪啶红亚甲蓝混合物作指示剂， 高氯酸作滴定液3、注意事项：

15、（1）加醋酸汞。（2）滴定度为16.86mg/ml。 VB1有两个碱性基团，与高氯酸反应的摩尔比为12（3）非水容量法可用于弱酸性特别是弱碱性药物及其盐类的含量测定。（4）此处仅适用于维生素B1的原料药含量测定（二）紫外分光光度法 1、原理：2、VB1片的含量测定测定方法： 以盐酸溶液 (91000)作溶剂，在246nm测定吸收度，按Cl2Hl7ClN4OSHCl的吸收系数 (百分吸收系数)为421计算，即得。ChP片剂、注射剂A = ECL= 421g/100ml规格g/片g（每ml）相当于标示量的%=ml规格g/ml（三）硫色素荧光法原理1、荧光硫色素异丁醇铁氰化钾1VitBNaOH通过与

16、对照品荧光强度的比较即可测得供试品含量2、实验操作 40 ml具塞试管3支对照品溶液5 ml；其中2支加入氧化试剂3.0 ml，再迅速加入异丁醇20 ml，振摇。第三支试管中加入3.5 mol/l的NaOH，同法操作为空白。 另取三支试管加入供试品，同法操作。 各试管中加入无水乙醇2 ml，分取异丁醇，进行荧光测定。3、结果计算特点4、（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于 体液分析（3）该法适用于VitB1的制剂含量分析（4）可用BrCN为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析维生素c的分析一、维生素C的概述 维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。

17、新鲜的水果蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。 维生素C有四种光学异构体，其中以 L-构型右旋体的生物活性最强。 维生素C的分析二、维生素结构与性质 1、结构特征 维生素c的分子结构与糖类十分相似，有内酯环、烯二醇结构结构中在C4、C5有两个手性碳原子性质活泼具有旋光性2、理化性质1）、溶解性： 分子为多羟基极性化合物 水中易溶 略溶于乙醇，在氯仿或乙醚中不溶 水溶液呈酸性2）、酸性 分子中具有的共轭烯二醇结构，使得C2和C3上羟基氢受共轭的影响易于解离，特别是C3羟基氢酸性较强（pK=4.17），而C2羟基氢酸性极弱（Pk=11.57）维生素C常表现为一元酸，可与碳

18、酸氢钠生成维生素C钠盐。3）、还原性 分子中的烯二醇基具有极强的还原性，易被氧化脱氢生成去氧抗坏血酸，后者也可加氢可逆还原成抗坏血酸。4）、旋光性 维生素C有2个手性碳原子，有4种光学异构体，其中，L-构型右旋体生物活性最强，所以又称为L-抗坏血酸。5）、水解性 在碱性或强酸性条件下能不可逆地水解生成二酮古洛糖酸而失活。L-抗坏血酸有活性L-去氧抗坏血酸有活性L-二酮古洛糖酸有活性 6）、紫外吸收特征 分子中的共轭体系，使维生素C的稀盐酸溶液在波长243nm处有最大吸收，吸收系数为560.在偏碱性的溶液中，随pH值升高，发生红移。可用于维生素C的。 三、维生素c的鉴别1、利用Vc所具有的强还原

19、性1、与硝酸银反应(1)方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取该溶液5m1，加硝酸银试液0.5m1，即生成银的黑色沉淀。 (2)原理：烯二醇基，具强还原性 2、与2，6二氯靛酚反应(1)方法：取本品0.2 g，加水l0ml溶解。取该溶液5m1，加2，6二氯靛酚试液12滴，试液的颜色即消失。原理：氧化型还原型蓝色OH玫瑰红色3、与其他氧化剂反应亚甲蓝或高锰酸钾 试剂褪色碱性酒石酸铜 砖红色沉淀磷钼酸 钼蓝（二）利用维生素C所具有糖类性质的反应或盐酸50吡咯（三）利用VC所具有的紫外吸收特性 维生素C在0.0lmol/L盐酸液中，在243nm 波长处有惟一的最大吸收，利用此特征进行鉴别。 BP

20、中采用该法，并规定其吸收系数应为545585之间四、Vc的杂质检查（一） 溶液颜色与澄清度检查 原料、片剂、注射剂均需检查，控制有色杂质 （二）铁和铜离子的检查 原料中 原子吸收光谱法 供试品 + 标准溶液 a 供试品 b 合格 b a- b 由于铁、铜离子会催化维生素C的氧化，所以在产品中特别规定了金属的限量检查。五、含量测定 具有较强的还原性，可被不同氧化剂定量氧化的性质。（一）碘量法1、原理指示剂 淀粉指示液H+方法2、 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每

21、1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O62，6 - 二氯靛酚钠滴定法法（二）USPJP原理1、酚亚胺二氯靛酚，-62VitC方法2、自身指示终点法（三）高效液相色谱法人血浆中VitC浓度的HPLC法测定1、色谱条件2、标准溶液的制备3、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法学考察5、测定 维生素D的分析是抗佝偻病维生素的总称。收载有：维生素D2、D3原料药、维生素D2胶丸和注射剂、维生素D3注射剂等。一、结构与性质维生素D2骨化醇维生素D3胆骨化醇1、脂溶性：在植物油中略溶，水中不溶2、不稳定性：含有多个烯键，不稳定，易氧化变质降低效价，毒性增加3、旋光性：维生

22、素D2有6个手性碳原子 维生素D3有5个手性碳原子4、显色反应：甾醇类化合物共有5、紫外吸收特性理化性质二、鉴别试验1. 显色反应醋酐-硫酸反应 D2 黄 红 紫 绿 D3 黄 红 紫、蓝绿 绿 三氯化锑反应 橙红色渐变粉红三氯化铁反应 橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色2. 比旋度鉴别溶 剂 浓 度 比旋度值维生素D2维生素D3无水乙醇无水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5+107.5+105+112注意事项：应于容器开启30分钟内取样， 在溶液配制后30分钟内测定。 3.区别反应： 以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色，在495nm

23、处有最大吸收。 4.其他方法： TLC、HPLC、制备衍生物测熔点三、杂质检查维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。前维生素D的光照产物四、含量测定方法 中国药典（2000年版）采用正相高效液相色谱法测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯，该法分为三个方法。固定相：硅胶流动相：正己烷-正戊醇（997：3）第一法：用于无维生素A醇及其它杂质的干扰的情况，步骤如下：1系统适用性试验：测定重复性和分离度。 2测定校正因子： A S /m S f1 = - A r /m r f2 =（A S m r- f1 m S A r1）/（A

24、r1 m S） 3含量测定： mi=（f1 Ai1+ f 2 A i2）m S /A S第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：1皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙 醚、制备供试液A。2净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维 生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制 备成供试液B。 固定相：ODS 流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2） 3含量测定：取供试液B按第一法测定。第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下：1制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，得供 试液C。 制备对照液：对照品储备液：稀释、加热。2含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样 对

25、照液和供试液，按外标法定量。维生素E的分析维生素E（vitamin）是一类与生育有关的维生素的总称，又名生育酚(tocopherol),包括生育酚和三烯生育酚两类共八种化合物，即、 、 、 生育酚和、 、 、 三烯生育酚， -生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素E形式。各国药典收载的维生素E为-生育酚及其各种酯类，有天然品与合成品之分。天然品为右旋体（b- )，合成品为消旋体(dl- )，右旋体与消旋体效价比为1.4:10。中国药典（2010年版）收载了合成型或天然型维生素E及其片剂 、软胶囊、注射剂和粉剂。 维生素E的分析一、结构及性质(一)结构 维生素E为苯骈二氢吡喃醇

26、衍生物，苯环上有一个乙酰化的酚羟基，故又称生育酚。有、和四种异构体，其中以异构体的生理作用最强。名 称R1R2相对活性-生育酚-生育酚 -生育酚 -生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1(二)理化性质1、溶解性 微黄色或黄色透明的粘稠液体 易溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中，不溶于水2、具有紫外吸收： VE的0.lmg/ml无水乙醇溶液在284nm波长处测定吸收度时，其吸收系数为41.045.0。3、易水解氧化：在无氧或其他氧化剂存在时，对热稳定在有氧或其他氧化剂存在时，遇光、空气可被氧化 二、鉴别试验（一）硝酸反应原理：7515橙红色强氧化剂HNO3生育红（橙红色）（二

27、）三氯化铁反应UV法（三）0.01%无水乙醇中max = 284nmmin = 254nm = 41.045.5TLC法（四）薄层板 硅胶G展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）显色剂 硫酸（105 5） 结果各物质的Rf值分别为：-生育酚为0.5-生育酚醋酸酯为0.7-生育酮的分别为0.9三、杂质的检查1、酸度 目的：制备过程引入的游离醋酸 方法：以NaOH滴定液（0.1mol/L0.5ml）体积控制。2、游离生育酚的检查 原理：利用游离生育酚的还原性，用硫酸铈滴定液 (0.0lmol/L)滴定，以二苯胺为指示剂，杂质的限量为2.15%。3.有关物质（合成型) 维生素E的合成步骤繁多，合成过程中会残存-生育酚及其他杂质，中国药典（2010年版）采用气相色谱法检查有关物质，以控制-生育酚及其他杂质的量。4.残存溶剂（天然型）-正已烷天然型维生素E的提取工艺中常残留一定量的正已烷，正已烷为限制使用的第二类溶剂， 中国药典（2010年版）采用气相色谱法检查，限度0.029%。四、含量测定 维生素E的含量测定方法很多，主要是利用其水解产物（游离生育酚）的易氧化性质，可在酸性或碱性条件下