动物细胞培养和核移植技术(上课用)1

1、动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、 动物细胞核移植、动物细胞融合、 单克隆抗体动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。提问：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养, 植物体细胞杂交第一页，共二十七页。 从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。一、动物细胞培养1 、动物细胞培养的概念第二页，共二十七页。动物组织块细胞悬液原代培养传代培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞（幼龄动物的器官、组织或胚胎）加入培养液用胰蛋白酶等处理贴壁细胞，使细胞从瓶壁脱落适宜条件2.动物细胞培养的过程第三页，共二十七页。细胞悬浮液细胞贴满

2、瓶壁50代细胞原代培养传代培养原代培养: 将动物组织经胰蛋白酶等处理后的初次培养。传代培养: 对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。第四页，共二十七页。动物组织单个细胞细胞悬液贴壁生长分瓶培养10代细胞50代细胞不死细胞原代培养传代培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶剪碎加培养液接触抑制少数癌变少数动物细胞培养技术流程失去接触抑制现象细胞核型不变第五页，共二十七页。 当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖细胞出现接触抑制。哪些细胞失去了接触抑制？ 传代培养时，少数超过50代的细胞，由于遗传物质发生改变，可无限增殖，并失去了接触抑制肿瘤细胞。接触抑制第六页，共二十七页。动物胚胎或

3、幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞50代细胞细胞株无限传代（不死性）细胞系遗传物质改变遗传物质未改变第七页，共二十七页。 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ P46讨 论充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境第八页，共二十七页。4、动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度

4、和PH 36.5+（-）0.54、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）保证细胞顺利的生长增殖维持培养液的PH第九页，共二十七页。5、动物细胞培养应用大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）作为基因工程中的受体细胞培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据第十页，共二十七页。思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要

5、成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体第十一页，共二十七页。细胞的全能性细胞株、细胞系植物体或组织培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目试一试第十二页，共二十七页。第二课时动物细胞培养和核移植技术第十三页，共二十七页。二.动物细胞核移植技术

6、和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。 分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易；细胞分化程度高，恢复全能性不容易1.动物细胞核移植概念：（难度高）第十四页，共二十七页。卵母细胞母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵母细胞第十五页，共二十七页。2、体细胞核移植的过程：请看教材P48图2-21思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？2.通过什么手段激活受

7、体细胞，构建重组胚胎？ M中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。第十六页，共二十七页。电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎卵母细胞采集、培养M中期卵母细胞供体牛供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植2.体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）原理：动物细胞核具有全能性显微操作第十七页，共二十七页。3.体细胞核移植技术的应用前景：1.加速家畜遗传改良的进程2.保护濒危物种3. 生产医用蛋白质及组织器官的移植4.了解胚胎发育

8、和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病第十八页，共二十七页。4、体细胞核移植技术存在的问题 P173（1）成功率非常低（2）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题 成功率低，绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷：如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。第十九页，共二十七页。讨论：（教材P49）1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。第二十页，共二十七页。 培养的动物细胞一般

9、当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？第二十一页，共二十七页。3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关

10、系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。第二十二页，共二十七页。1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因。细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞 拓展-动物组织或细胞培养的难易程度幼体组织或细胞 老龄

11、组织或细胞分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞思考与探究（教材P50）第二十三页，共二十七页。思考与探究（教材P50）2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。第二十四页，共二十七页。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶

12、牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。第二十五页，共二十七页。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移