中药分析中供试品的制备

1、中药分析中供试品的制备第1页，共59页。讲授提纲第一节 取样第二节 样品的提取第三节样品的净化第四节样品提取液的浓缩第五节样品的衍生化第六节不同类型中药样品的预处理特点2第2页，共59页。样品预处理有效释放被测成分，并制成便于分析测定状态除杂、纯化，提高重现性和准确度富集、浓缩、衍生化，提高灵敏度和选择性使试样的形式及所溶剂符合分析测定要求3最大限度地保留被测成分，除去干扰物质，将被测定成分浓缩至高于分析方法最小检测限所需浓度第3页，共59页。第一节取 样4取样鉴别含量测定检查提取纯化样品粉碎科学性、真实性、代表性均匀合理第4页，共59页。一、抽样5常用术语包装件、最小包装批、抽样批抽样单元、

2、最终样品抽样单元的确定随机抽样法：简单、分段偶遇抽样法针对性抽样抽样量一般药材和饮片：100500g/包粉末状药材和饮片：2550g/包贵重药材和饮片：510g/包抽样方法中药材和饮片的抽样中药提取物的抽样中药制剂的抽样第5页，共59页。 6二、样品的粉碎使所取样品均匀、有代表性，提高精密度和准确度粉碎机匀浆机研钵能快而充分地提取样品中被测组分第6页，共59页。取样均匀合理气体固体，圆锥四分法半液体，硅藻土拌液体，混合均匀7三、取样保留一半数量作留样观察, 时间为半年或一年第7页，共59页。浸渍法操作简单，适于热不稳定的样品费时、费溶剂、提取不充分，含测少用超声提取法简便、快速、高效，通常30

3、min应规定提取功率和提取频率回流提取法提取效率高，时间短，但杂质较多对热不稳定或具有挥发性成分不宜使用8第二节样品提取第8页，共59页。9供试品溶液的制备 取本品粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理(功率250W，频率50kHz)20分钟，滤过，滤渣和滤纸再加甲醇10ml，同法超声处理一次，滤过，加甲醇适量洗涤2次，合并滤液和洗液，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。（荆芥项下胡薄荷酮含量测定）第9页，共59页。连续回流提取法提取效率高，所需溶剂少，提取杂质少，操作简便受热易分解的成分不宜使用水蒸气蒸馏法提取杂质少，操作简便适用于挥发性成

4、分，可利用盐析作用消化法降低有机物干扰，分干法和湿法适用于以元素为测定对象10第二节样品提取第10页，共59页。11供试品溶液的制备 取本品中粉约4g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml（黄芪中黄芪甲苷）第11页，共59页。超临界流体萃取法（CO2）安全，价廉，易于操作，环保较适用于中低极性成分的提取加压溶剂萃取法提取率高价格昂贵微波辅助萃取法快速，省溶剂、多样品同时提取萃取溶剂选择性高，可与HPLC相连12第二节样品提取第12页，共59页。13超临界流体萃取法（CO2）设备加压溶剂萃取法设备微波辅助萃取

5、法设备第13页，共59页。14不同分析目的样品的提取实验目的方法要求常用方法供鉴别用针对待检成分的溶解性能选择适宜的提取溶剂，提取方法力求简便、易操作超声，加热回流提取，浸渍法供杂质检查用无机杂质检查用消化法；有机杂质的检查可按常规的鉴别或含量测定的方法提取定量杂质：定量方法定性杂质：鉴别方法供含量测定用特别强调待测成分要提取完全超声处理法、加热回流法和连续回流法第14页，共59页。第三节样品的分离净化沉淀法 蒸馏法液-液萃取法色谱法消化法15第15页，共59页。161、沉淀法 利用某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液以得到精制的方法例水苏碱+雷氏盐 生物碱雷氏盐沉淀H+第16

6、页，共59页。172、萃取法 利用被测成分与干扰成分溶解性能的不同进行分离，使物质从一种溶剂转移到另一种溶剂中，将测定组分提取出来的方法例生物碱盐氨水H2O第17页，共59页。18正丁醇 用于皂苷类醋酸乙酯 用于黄酮类三氯甲烷 用于生物碱类乙醚、石油醚 用于挥发油（1）萃取溶剂的选择直接萃取：第18页，共59页。19（2）水相pH的选择酸性成分 比其pKa低12个pH单位碱性成分 比其pKa高12个pH单位第19页，共59页。20（3）仪器和提取次数（4）乙醇提取液先挥去乙醇（5）防止和消除乳化分液漏斗鉴别1次含量测定 3 4次第20页，共59页。21离子对萃取：萃取（离子对）有机相有机酸生物

7、碱+ 离子对试剂 （离子对）水相 第21页，共59页。22例，华山参片中生物碱含量测定取本品40片，除去糖衣，精密称定，研细，精密量取适量（约相当于12片的重量），置具塞锥形瓶内，精密加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）25mL，振摇5分钟，放置过夜，用干燥滤纸滤过，取续滤液，精密量取续滤液2mL，置分液漏斗中，精密加枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）10mL，再精密加入0.04%溴甲酚绿溶液2mL，摇匀，用10mL三氯甲烷振摇提取5分钟，待溶液完全分层后，分取三氯甲烷液，用三氯甲烷湿润的滤纸滤入25mL量瓶中，再用三氯甲烷提取3次，每次5mL，依次滤入量瓶中，并用三氯甲烷洗涤滤纸，

8、滤入量瓶中，加三氯甲烷至刻度。第22页，共59页。233、色谱法（1）保留测定组分在柱上，洗去杂质，再用适当溶剂洗下组分（2）保留杂质于柱上-简便，精制效果好，被普遍使用第23页，共59页。24常用固定相硅胶氧化铝键合相硅胶大孔吸附树脂-皂苷类聚酰胺-黄酮类硅藻土、纤维素200-100目,1-10g机理：吸附第24页，共59页。25例 烧伤灵酊中大黄素的含量测定 【处方】虎杖 黄柏 冰片 精密量取本品2mL，加硅胶（色谱用，60160目）1g，置温水浴上蒸干，加在硅胶柱（色谱用，60160目，2g，内径为1.7cm）上，用石油醚（6090）-甲酸乙酯-甲酸（100:100:2）混合液90mL分

9、次减压洗脱，收集洗脱液，置100mL量瓶中，并用混合溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。第25页，共59页。26例 复脉定胶囊中黄芪含量测定【处方】党参 黄芪 远志 桑椹 川芎 取本品20粒的内容物，精密称定，研细，混匀，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试剂充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，通过D101型大孔树脂柱（内径为1.5cm，柱高为12cm），用水50mL洗脱，再用40%乙醇3

10、0mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。第26页，共59页。274、固相萃取法通过吸附剂与目标化合物之间的相互作用来保留/吸附疏水作用：C18、C8、silica离子交换作用：SAX, SCX,COOH，NH2等物理吸收：Florsil、Alumina等第27页，共59页。28Sep-Pak C18柱： 30-60um一般操作程序：（1）柱的活化（2）上样（3）清洗（4）洗脱第28页，共59页。29例新雪颗粒中栀子的鉴别【处方】磁石 石膏 滑石 南寒水石 硝石 栀子等取本品1.5g，研细，加正己烷10

11、mL，充分振摇，放置30分钟，滤过，滤渣加甲醇10mL，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5mL使溶解，离心15分钟（转速为每分钟3000转），上清液通过十八烷基硅烷键合硅胶固相萃取小柱（500mg），以水10mL洗脱，弃去洗液，再用甲醇15mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。第29页，共59页。305、固相微萃取法SPME是在SPE基础上发展起来的，保留了SPE的优点，克服了SPE样品预处理技术的缺陷，即无需柱填充物和使用溶剂解吸被测组分的前处理，它能直接从样品中采集挥发和非挥发性的化合物，然后直接在GC、GC/MS、HPLC和HPCE上分析，集采样、

12、提取、浓缩、进样于一体。优点：费用低、操作简单、省时、环保缺点：离子交换作用：SAX, SCX,COOH，NH2等第30页，共59页。第四节样品提取液的浓缩方法适用成分适用检测备注水浴蒸发热稳定性好的成分薄层自然挥散小体积提取液或挥发性强溶剂，乙醚薄层减压蒸发对热不稳定的样品残留分析温度低、速度快气流吹蒸法少量液体，氮吹法特别适用于结构不稳定、易氧化的化学成分定量氮气流可以防止氧化冷冻干燥热不稳定的生物样品定量干燥后的物料保持原来的化学组成和物理性质；热量消耗比其他干燥方法少31第31页，共59页。例当归流浸膏的鉴别取本品3mL，加1%碳酸氢钠溶液50mL，充分振荡，用稀盐酸调节pH值至23，

13、用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。32第32页，共59页。第四节样品的衍生化33种类衍生化目的衍生化方法提高成分的挥发性增加成分的稳定性生成非对映异构体硅烷化酰化烷基化不对称衍生气相例气相色谱法测定鸦胆子中油酸的含量 甲酯化 校正因子测定：取油酸对照品适量，精密称定，加正己烷制成每1mL含3mg的溶液。精密量取5mL，置10mL具塞试管中，用氮气吹干，加入0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液2mL，置60水浴中皂化25分钟，至油珠全部消失，放冷，加15%三氯化硼乙醚溶液2mL，置60水浴中甲酯化2分钟，第33页，共59页。34续例气相色谱法

14、测定鸦胆子中油酸的含量 放冷，精密加入正己烷2mL，振摇，加饱和氯化钠溶液1mL，振摇，静置，取上层溶液作为对照品溶液。精密称取苯甲酸苯酯适量，加正己烷制成每1mL含8mg的溶液，作为内标溶液。精密量取对照品溶液和内标溶液各1mL，摇匀，吸取1L，注入气相色谱仪，测定，计算校正因子。第34页，共59页。35种类衍生化目的反应要求提高检测的灵敏度改善色谱分离效果反应要求不苛刻，且迅速定量单一衍生化产物，副产物不干扰衍生化试剂易得、通用性好高效液相衍生化方法在线离线柱前柱后紫外衍生化荧光衍生化非对映衍生化第35页，共59页。36例16，HPLC法测定阿胶中氨基酸的含量对照品溶液的制备：取L-羟脯氨

15、酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-羟脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1mL分别含L-羟脯氨酸80g、甘氨酸0.16mg、丙氨酸70g、L-脯氨酸0.12mg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品粗粉约0.25g，精密称定，置25mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液20mL，超声处理（功率500W，频率40Hz）30分钟，放冷，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。精密量取2mL，置5mL安瓿中，加盐酸2mL，150水解1小时，放冷，移至蒸发皿中，用水10mL分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25mL量瓶中，加

16、0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。第36页，共59页。37精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各5mL，分别置25mL量瓶中，各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5mL，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5mL，摇匀，室温放置1小时后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10mL，加正己烷10mL，振摇，放置10分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取衍生化后的对照品溶液与供试品溶液各5L，注入液相色谱仪，测定，即得。第37页，共59页。38第六节不同类型中药样品的预处理特点固体中药样品的预处理特点半流体中药样品的预处理特点液体中药样品的预处理特点第38

17、页，共59页。396.1 固体中药样品的预处理特点样品中药材/饮片丸剂特点待检成分存在于细胞中，细胞壁坚硬，成分不易溶出蜜丸中有蜂蜜干扰方法粉碎(2-4#筛)超声处理或加热回流加定量硅藻土1:0.52（g/g）稀盐酸浸泡除铁离子第39页，共59页。40例天王补心丸中五味子的含量测定【处方】丹参 当归 石菖蒲 党参 茯苓 五味子等 取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理（功率180W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续

18、滤液，即得。第40页，共59页。416.1 固体中药样品的预处理特点样品片剂颗粒剂特点赋形剂（水溶性），饮片细粉多数经提取、纯化，但有糖/糊精等辅料干扰方法粉碎过筛(去糖衣)选择适宜的溶剂注意提取溶剂的渗透性提取液杂质多时需精制第41页，共59页。42例复方丹参片中丹参、冰片的鉴别【处方】丹参 三七 冰片取本品5片，糖衣片除去糖衣，研碎，加乙醚10mL，超声处理5分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2mL使溶解，作为供试品溶液。 例双黄连颗粒中金银花、黄芩的鉴别【处方】金银花 黄芩 连翘取本品1g，加75%乙醇溶液10mL，摇匀，置水浴中加热振摇使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。第42页，共5

19、9页。436.1 固体中药样品的预处理特点样品散剂栓剂特点剧毒成分和贵重药味成分成分在饮片组织中，分布不均匀注意取样代表性基质干扰的去除方法可用显微鉴别冷浸/热回流/连续回流/超声必要时需精制高低温度法硅藻土拌样提取法酸碱性变化法第43页，共59页。44例 双黄连栓中金银花、黄芩的鉴别【处方】金银花 黄芩 连翘 取本品1粒，加水20mL，置温水浴中，用10%氢氧化钠溶液调节pH值至7.07.5，使熔化，置冷处使基质凝固，滤过，取滤液10mL，加无水乙醇4mL，至水浴中振摇数分钟，放置，取上清液作为供试品溶液。例 九分散中士的宁的含量测定【处方】马钱子粉 麻黄 乳香（制） 没药（制） 取本品约2

20、g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加三氯甲烷20mL与浓氨试液1mL，轻轻摇匀，称重，于室温放置24小时，再称重，补足三氯甲烷减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取续滤液10mL，用硫酸溶液（3100）分次提取至生物碱提尽，合并硫酸液，加浓氨试液使呈碱性，用三氯甲烷分次提取，合并三氯甲烷液，蒸干，精密加三氯甲烷5mL使残渣溶解，作为供试品溶液。第44页，共59页。456.1 固体中药样品的预处理特点样品胶囊剂滴丸特点硬胶囊剂应倾出全部内容物软胶囊剂应用提取溶剂洗涤囊壳基质干扰的去除方法可用显微鉴别冷浸/热回流/连续回流/超声必要时需精制高低温度法硅藻土拌样提取法酸碱性变化法第45页，共59页。4

21、6例复方丹参滴丸中丹参的鉴别【处方】丹参 三七 冰片 取本品15丸，置离心管中，加水1mL和稀盐酸2滴，振摇使溶解，加入乙酸乙酯3mL，振摇1分钟后离心2分钟，取上清液作为供试品溶液。例藿香正气软胶囊中苍术的鉴别【处方】苍术 陈皮 厚朴 白芷 茯苓 大腹皮 生半夏 甘草浸膏等取本品4粒的内容物，加硅藻土1g，研匀，加环己烷20mL，超声处理15分钟，过滤，滤液低温蒸干，残渣加正己烷2mL使溶解，作为供试品溶液。第46页，共59页。476.2 半流体中药样品的预处理特点样品煎膏剂浸膏剂特点炼蜜或糖干扰的去除杂质相对较少方法加适量惰性材料，低温烘干后，按固体样品处理稀释后，按液体样品处理法个别可稀

22、释后直接测定稀释后提取法、回流提取法及柱色谱分离法第47页，共59页。48例阿胶三宝膏中黄芪的含量测定【处方】阿胶 大枣 黄芪 取本品10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入等量的硅藻土，拌匀，在60烘干（适时搅拌），放冷，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50mL，蒸干，残渣加水25mL使溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，每次25mL，合并正丁醇液，正丁醇液用氨试液洗涤2次，每次25mL，合并氨试液，氨试液再用水饱和的正丁醇25mL提取，合并正丁醇提取液，回收正丁醇至干，残渣加甲醇适

23、量使溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。第48页，共59页。49例刺五加水浸膏浸出物测定【处方】刺五加取本品2.5g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加水25mL使溶散（必要时以玻璃棒搅拌使溶散），再精密加水25mL冲洗瓶壁及玻璃棒，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，置己干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。第49页，共59页。506.2 半流体中药样品的预处理特点样品凝胶剂特点基质干扰的去除方法根据水溶性/油溶性基

24、质性质差异，参照栓剂预处理方法第50页，共59页。516.3 液体中药样品的预处理特点样品合剂/口服液酒剂/酊剂/流浸膏剂特点粘度大，需净化杂质相对较少方法液-液萃取法/柱色谱法调酸碱性后再萃取个别可直接测或加热蒸去乙醇，然后再用适当的有机溶剂抽提/柱层析第51页，共59页。52例藿香正气水中甘草的鉴别【处方】苍术 陈皮 厚朴（姜制） 白芷 茯苓 甘草浸膏等取本品30mL，蒸至无醇味，用乙醚振摇提取2次，每次10 mL，弃去乙醚液，用正丁醇振摇提取3次，每次10mL，合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次10mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶液2mL使溶解，作为供试品溶液。第52页，共59页。536.3 液体中药样品的预处理特点样品注射剂糖浆剂特点杂质相对较少糖干扰的去除方法HPLC可直接测TLC需液-液萃取法/柱色谱法净化液-液萃取（调pH值）蒸馏柱层析第53页，共59页。54例 注射用双黄连（冻干）中金银花的含量测定【处方】连翘 金银花 黄芩 取本品60mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。例小儿止咳糖浆中氯化铵的含量测定【处方】甘草流浸