15种蛋白质单晶培养的方法

1、15 种蛋白质单晶培养的方法：大量养晶法(bulk crystallization):若急着养出单晶，则将纯化之蛋 白质溶液加入固体盐类或饱和盐液，直到溶液中出现乳白混浊色，离心后把上清 液(supperna tan t)放置数天至数周，有可能养出单晶。批次养晶法(batchmethod):若发现加入蛋白质的沉淀剂和盐类等化学药 品，在浓度C1产生沉淀，浓度Cn为液体，则在C1至Cn之间细分成一串浓度 ClC2C3.CiCn,(n-2)个小试管进行养晶，可能结出单晶。此法之主要 缺点在于蛋白质的消耗量大。大量透析法(bulk dialysis):把蛋白质溶液包在半透膜(nembrane)内，

2、浸入盛有化学药品的器皿中，半透膜能让小分子进出，却不会让蛋白质等大分子 通过，则器皿中沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜，与蛋白质起 作用，直到膜之内外的浓度梯度(concentrationgradient)降到零为止。此法 的好处在于，器皿中化学药品之浓度可作连续之调整， pH 值的范围也可探讨。 坏处是膜之内外浓度差异减少时，平衡速率也随之降低。微量透析法(microdialysis):把半透膜的体积缩小，绑在比钮扣略大的 衬架上，架体之凹槽内注入蛋白质溶液，包覆半透膜的体架放入盛有化学药品的 器皿，其养晶原理与大量透析法相同，只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。 注意凹槽内不得

3、留有气泡，否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡， 渗入膜内的蛋白质溶液。连续萃取(sequen tial ext rac ti on)：此法所根据的原理是亚可比(Jacoby) 的实验，他发现蛋白质在硫酸铵溶液中溶解度随温度的提升而下降。在4T以下 取得上清液(superna tant),放在室温长晶。先将蛋白质溶液加入固体硫酸铵 或饱和硫酸铵液体，使蛋白质溶液沉淀，离心除去上清液。接着保持4C以下处 理一系列的蛋白质沉淀物。准备数种依次递降浓度的沉淀剂(通常为蒸馏水)， 浓度高的沉淀剂先加入上述蛋白质沉淀物中，以玻棒搅拌并离心，取出上清液， 放在室温养晶，再把浓度次高的沉淀剂加入上次

4、未完全溶解的蛋白质沉淀物，搅 拌离心，把上清液置于室温养晶，依次类推，直到蛋白质全部溶解为止。这样每 次取出的蛋白质浓度依次递减，溶液由低温移至高温，符合亚可比的准则，可能 养出蛋白质单晶。自由接口间的扩散法(free interface diffusion):若蛋白质在不同的 溶剂中具有不同的溶解度，则蛋白质注入盛有沉淀剂试管的上方或下方(依密度 而定，密度大者放在下方)，在两种溶液的交界面扩散会有晶核长出，装置如图 7-10 所示。凹盘或玻片上的蒸汽扩散法(vapor diffusion on plates or slide 座滴法:蛋白质养晶的要领在于蛋白质达成过饱和溶液，同时添加的化学

5、药物与 蛋白质起作用，协助晶核的形成。掺有化学药品的蛋白质溶液，其水分慢慢扩散， 达到过饱和溶液则有可能长出单晶。若蛋白质溶液暴露在空气中，水分蒸发掉， 则蛋白质干涸，无法形成单晶，原因是蛋白质单晶约略维持液态的结构，含有大 量水分，水分与蛋白质间形成许多氢键，水分蒸发，蛋白质也无以为系，因此必 须保持水分，使蛋白质溶液密闭在一个容器中。同时还得调节水分，所以必须置 放两种溶液，使蛋白质溶液中的水分扩散到另一种高浓度的溶液中，以达蛋白质 溶液的过饱和。通常选择适当的盐类和有机溶剂，调在等电点的 pH 值，形成沉 淀剂，把粉晶蛋白质泡成一定浓度，约在540mg/ml之间，在凹盘的下凹孔镀 硅，注

6、入一些蛋白质溶液和沉淀剂总共1040 m l。在凹盘外方的塑料盒，倒 入2030ml的沉淀剂。在塑料的四周涂真空油膏(Vacuum grease),加以密圭寸。 通常这样的塑料盒对于每种养晶条件制备两盒，一盒放在4C的低温，另盒放在 室温，待其长晶，快则一周，慢则数月，幸运的话，可望长出单晶。通常一次制 备数拾条件，大量养晶。要鉴定长出的单晶确实是蛋白质而不是滴入的沉淀剂等 化学药品。若养出蛋白质单晶太小，不足以供X光绕射实验使用，则可使用连续 播种法把小晶粒养大：依照养出蛋白质小单晶的条件，炮制母液(蛋白质溶液配 合沉淀剂)，注入凹孔，外围倒注沉淀剂，加以密封，等待约半天后，打开封盖， 把以

7、前所养的小晶粒稍加清洗后放入，企图长大，若长出的晶体仍然不符X光使 用，则把最后一次的晶体当新晶种，再继续播种，直到晶体够大。此种养晶法的 好处是：用量少，筛选多种条件相当理想;易于修饰塑料盒内沉淀剂的浓度。此 种养晶法装置，也可用具有凹槽的玻片来取代，在其一凹孔注入10m l的母液， 另一凹孔注入2040m l的沉淀剂，以小玻片密封，等待长晶。悬滴液蒸汽扩散法(vapor diffusion in hanging drops) 一悬滴法：它 在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽达到平衡，利用少量蛋白质筛选多种养晶条件。 此法用量比座滴液更少。在方形或圆形的玻片上镀硅，滴入少于10ml的蛋白质 母液

8、，在培养皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀剂，把方形玻片翻转，盖在凹槽 孔缘，加以密封，形成悬滴液，进行扩散，蛋白质溶液达到过饱和，长出单晶。液体桥连法(liquid bridge)如图7T2(b)所示，一小滴母液和一滴沉淀 液分别滴在玻璃片的两靠近处，以细针引导细桥相接，把此载有液滴的玻片放在 密圭寸容器中，在细桥相连处可望长出单晶。(10)浓度透析法(concentration dialysis):，离子强度弱，则蛋白质溶解度低，易形成晶核，长出单晶，可利 用氮气在装有蛋白质和盐类的透析袋内施压，使盐类穿透透析膜流出，降低袋内 盐类浓度，使蛋白质溶液在低离子强度下长出单晶。pH引导长晶法(c

9、rystallization induced by pH):蛋白质的溶解度在等 电点的pH值最低，是个良好的养晶条件。有些蛋白质在不同的数个pH值，具有 数个溶解度的极小，这些溶解度极小处可望长晶。利用透析法改变透析膜外的 pH 值是个好办法。也可在蒸汽扩散法中，在外围滴入挥发性酸或碱(如氨水或 干冰等)来调节 pH 值。温度长晶法(temperature crystallization):蛋白质溶解度为温度的 函数，有些溶解度非常温度敏感。通常温度降低，分子排列较有秩序，引起能趋 疲(熵)(entropy)的降低。由液体转变到固体，其熵会降低，反之亦然。井 然有序排列的分子易于长晶。通常一种长晶条件泡两份，一份置于室温，另一份 放在4C的冰箱。蒸发(evaporation):这是最原始的方法，为小分子的长晶常用法，也 是某些蛋白质常用的养晶法。在蛋白质不变性的条件下，慢慢让母液蒸发，使蛋 白质溶液达到过饱和，结出单晶。填加有效分子法(effector addition):与有效分子(effector)结合 的蛋白质，其溶解度往往与无有效分子结合者差异大，可达到某些构象(conformation)平衡状态的存在，养出此种构象单晶，通常的有效分子有配位 体(ligand)和基质(substrate)等。对蒸馏水透析法(dialysis against wat