蛋白质的结构与功能

1、蛋白质的结构与功能第一页，共118页。蛋白质的结构与功能第1章Structure and Function of Protein生物化学与分子生物学系陈园园第二页，共118页。重 点 内 容氨基酸与多肽1) 氨基酸的结构与分类2) 肽键与肽链4. 蛋白质的理化性质蛋白质变性3. 蛋白质结构与功能的关系1) 蛋白质一级结构与功能的关系2) 蛋白质高级结构与功能的关系2. 蛋白质的结构1) 一级结构概念2) 二级结构螺旋3) 三级和四级结构概念第三页，共118页。什么是蛋白质?蛋白质 (protein) 是由许多氨基酸 (amino acids) 通过肽键 (peptide bond) 相连形成的

2、高分子含氮化合物。第四页，共118页。蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物体重要组成成分作为生物催化剂（酶）；代谢调节作用；免疫保护作用；物质的转运和存储；运动与支持作用；参与细胞间信息传递2. 蛋白质具有重要的生物学功能3. 氧化供能分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体固体成分的45%， 某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等，高达80%第五页，共118页。第一节 蛋白质的分子组成第二节 蛋白质的分子结构第三节 蛋白质结构与功能的关系第四节 蛋白质的理化性质第五节 蛋白质的分离、纯化与结构分析第六页，共118页。蛋白

3、质的分子组成第一节The Molecular Component of Protein第七页，共118页。组成蛋白质的元素 主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 第八页，共118页。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量 (g %)= 每克样品含氮克数 6.25100蛋白质元素组成的特点凯氏定氮法第九页，共118页。已知一蛋白溶液，测得该溶液中氮含量为4%，则该溶液中蛋白质的浓度为？第十页，共1

4、18页。一、20种氨基酸存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。与COOH相连的碳为碳，依次为碳-氨基酸：即COOH与NH2连接于同一个C原子上 6 5 4 3 2 1 CH2CH2CH2CH2CHCOO- +NH3 +NH3赖氨酸第十一页，共118页。 H O CHO C H CH2OH O H CH C OH CH2OH -O O CH3N+ C H CH3 O O- CH C NH3+ CH3L-甘油醛L-丙氨酸D-甘油醛D-丙氨酸旋光性L型、D型醛基在上，醇在下，如果羟基在左侧，为L型， 羟基在右侧，为D型，两者镜面对称。

5、将-COOH画在顶端，垂直画一个氨基酸，然后与立体化学参考化合物甘油醛相比较，-氨基位于-碳左边的为L-异构体，位于右边的为D-异构体。镜面第十二页，共118页。氨基酸的通式 COO- H3N+CH R-羧基-氨基-碳原子侧链第十三页，共118页。非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸芳香族氨基酸二、氨基酸的分类第十四页，共118页。（一）非极性脂肪族氨基酸杂环氨基酸，是唯一的一个亚氨基酸结构式中文名英文名缩写甘氨酸glycineGlyG丙氨酸alanineAlaA缬氨酸valineValV亮氨酸leucineLeuL异亮氨酸isoleucineIleI脯氨酸prolinePro

6、PHCHCOO- +NH3CH3CHCOO- +NH3CH3CHCHCOO- CH3 +NH3CH3CHCH2CHCOO- CH3 +NH3CH3CH2CHCHCOO- CH3 +NH3 CH2 CHCOO-CH2 NH2+ CH3易溶于水，有的教材也将其归为极性中性氨基酸第十五页，共118页。（二）极性中性氨基酸结构式中文名英文名缩写丝氨酸serineSerS半胱氨酸cysteineCysC蛋氨酸(甲硫氨酸)methionineMetM天冬酰胺asparagineAsnN谷氨酰胺glutamineGlnQ苏氨酸threonineThrTHOCH2CHCOO- +NH3HSCH2CHCOO-

7、+NH3CH3SCH2CH2CHCOO- +NH3 CH3 HOCHCHCOO- +NH3CCH2CH2CHCOO- +NH3OH2NCCH2CHCOO- +NH3OH2N第十六页，共118页。（三）酸性氨基酸结构式中文名英文名缩写天冬氨酸aspartic acidAspD谷氨酸glutamic acidGluEHOOCCH2CHCOO- +NH3HOOCCH2CH2CHCOO- +NH3第十七页，共118页。（四）碱性氨基酸结构式中文名英文名缩写赖氨酸lysineLysK精氨酸arginineArgR组氨酸histidineHisHNH2CH2CH2CH2CH2CHCOO- +NH3 NH

8、NH2CNHCH2CH2CH2CHCOO- +NH3HCCCH2CHCOO- N NH +NH3 C H第十八页，共118页。（五）芳香族氨基酸结构式中文名英文名缩写苯丙氨酸phenylalaninePheF色氨酸tryptophanTrpW酪氨酸tyrosineTyrYCH2CHCOO- +NH3CH2CHCOO- +NH3HO CH2CHCOO- +NH3第十九页，共118页。几种特殊氨基酸脯氨酸（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2第二十页，共118页。半胱氨酸 胱氨酸-HH-OOC-CH-CH2-SH +NH3HS-CH2-CH-COO- +NH3+-OOC-CH-CH2-

9、SS-CH2-CH-COO- +NH3 +NH3二硫键第二十一页，共118页。三、氨基酸的理化性质两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。（一）氨基酸具有两性解离的性质等电点 (isoelectric point, pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点第二十二页，共118页。兼性离子 H3N+CHCOOH RpH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI阳离子阴离子pHpI，想象成将氨基酸扔入NaOH中H2NCHCOOH RH3N+CHCOO- RH2NCHCOO-

10、 R第二十三页，共118页。（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280nm 附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收只有含共轭双键的芳香族氨基酸才具有紫外吸收性质。第二十四页，共118页。（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，于570nm处有吸收峰。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。 COOH HCNH2 + ROHOHO O O HCR + NH3 + CO2 +HOHO O

11、氨基酸 茚三酮 还原型茚三酮HOHO O+ NH3 +OHOHO OO OO ON+ 3H2O蓝紫色化合物第二十五页，共118页。四、多肽链肽键 (peptide bond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽 (peptide)第二十六页，共118页。 O O NH2CHCNCHC R1 H R2 OH+-HOH O NH2CHC R1 OH氨基酸1 O NHCHC H R2 OH氨基酸2 O NCHC H R3 OH O NHCHC H R3 OH氨基酸3+R1、R2、R3可以是相同或不同的基团肽键第二十七页，共118页。H

12、OOCCHCH2COOH NH2HCHCOOH NH2HOOCCHCH2CNCH2COOH NH2 O HHOOCCH2CHCNCH2COOH NH2 O HAB第二十八页，共118页。肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基 (residue)。由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽 (oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽 (polypeptide)。ACTH（促肾上腺皮质激素）由39个氨基酸残基构成，Insulin（胰岛素）由51个氨基酸残基构成，CaSR（钙

13、敏感蛋白）由1088个氨基酸残基构成。第二十九页，共118页。多肽链有两端：N-端（氨基末端）多肽链中有游离-氨基的一端；C-端（羧基末端）多肽链中有游离-羧基的一端。多肽链 (polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。方向：蛋白质的生物合成方向一定是从N-端向 C-端，人工合成则随意。第三十页，共118页。牛核糖核酸酶C末端N末端第三十一页，共118页。 1. 谷胱甘肽 (glutathione, GSH)巯基肽键作用：氧化自由基，副产物：H2O2、O2-人体的细胞都处于还原环境消除ROS H2C H2C HCNH2 HOOC O CN HSH CH2

14、CH C ONHCH2 COO-谷氨酸 半胱氨酸 甘氨酸（二）体内存在多种重要的生物活性肽第三十二页，共118页。GSH过氧化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶NADPH+H+ NADP+ GSH与GSSG间的转换 2个半胱氨酸 胱氨酸还原型氧化型二硫键第三十三页，共118页。 体内许多激素属寡肽或多肽 促甲状腺素释放激素 (TRH)2. 多肽类激素及神经肽三肽 O O N CNCHCN H CH2 O=NHN C=O NH2焦谷氨酸 组氨酸 脯氨酰胺HOOCCH2CH2CHCOO- +NH3第三十四页，共118页。蛋白质的分子结构 第二节The Molecular St

15、ructure of Protein第三十五页，共118页。蛋白质的分子结构包括: 高级结构一级结构 (primary structure)二级结构 (secondary structure)三级结构 (tertiary structure)四级结构 (quaternary structure)第三十六页，共118页。定义：蛋白质的一级结构 (primary structure) 指 蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。一、蛋白质的一级结构主要的化学键： 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。 第三十七页，共118页。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯

16、一因素。第三十八页，共118页。二、蛋白质二级结构定义：蛋白质的二级结构 (secondary structure)是指 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构， 即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置， 并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。主要的结构单位：肽单元 (peptide unit)主要的化学键：氢键 (hydrogen bond)第三十九页，共118页。（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式 (trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit)。23第四十页，

17、共118页。-螺旋 (-helix) -折叠 (-pleated sheet)-转角 (-turn)无规卷曲 (random coil) 常见的蛋白质二级结构第四十一页，共118页。（二）-螺旋是最常见的二级结构右手螺旋；氨基酸侧链伸在外侧第四十二页，共118页。（三）-折叠使多肽链形成片层结构肽链充分伸展第四十三页，共118页。第四十四页，共118页。（四）-转角和无规卷曲-转角无规卷曲：没有确定规律性的那部分肽链结构。第四十五页，共118页。（五）模体是具有特殊功能的超二级结构二级结构组合形式有3种：，。两个或两个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，称为

18、超二级结构。第四十六页，共118页。钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构-螺旋-转角/环-螺旋模体链-转角-链模体链-转角-螺旋-转角-链模体模体常见的形式模体 (motif)：是具有特殊功能的超二级结构，是由两个 或三个具有二级结构的肽段，在空间上 相互接近，形成一个特殊的空间构象。第四十七页，共118页。（六）侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。 第四十八页，共118页。三、蛋白质三级结构主要的化学键： 疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。定义：蛋白质的三级结构 (ter

19、tiary structure)是指 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。 即整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。（一）三级结构第四十九页，共118页。第五十页，共118页。 肌红蛋白 (Mb) N端 C端第五十一页，共118页。纤连蛋白分子的结构域（二）结构域分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域，并各行其功能，称为结构域 (domain)。第五十二页，共118页。（三）分子伴侣分子伴侣 (chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。 分

20、子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。 第五十三页，共118页。现已鉴定出来的分子伴侣中研究最清楚的是热休克蛋白。热休克蛋白 Heat Shock Proteins (HSPs)是在从细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质。当机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性，为Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60以及小分子热休克蛋白 (sHSPs)。Hsp60PGroE系统由GroES蛋白和GroEL蛋白组成，作为分子伴侣，它们能指导新生蛋白质的

21、正确折叠和组装，并能使变性蛋白质恢复。第五十四页，共118页。伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用第五十五页，共118页。亚基之间的结合主要是氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构 (quaternary structure)。有些蛋白质分子含有两条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。第五十六页，共118页。由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体 (homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体 (heterodimer)。 血红蛋白的四

22、级结构第五十七页，共118页。五、蛋白质的分类根据蛋白质组成成分:单纯蛋白质结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分根据蛋白质形状:纤维状蛋白质：长轴/短轴10球状蛋白质第五十八页，共118页。蛋白质家族（protein family）：氨基酸序列相似而且空间结构与功能也十分相近的蛋白质。属于同一蛋白质家族的成员，称为同源蛋白质（homologous protein）。蛋白质超家族（superfamily）：2个或2个以上的蛋白质家族之间，其氨基酸序列的相似性并不高，但含有发挥相似作用的同一模体结构。自学第五十九页，共118页。六、蛋白质组学（一）蛋白质组学基本概念蛋白质组是指一种细胞或一

23、种生物所表达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。 自学第六十页，共118页。（二）蛋白质组学研究技术平台蛋白质组学是高通量，高效率的研究:双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析 （三）蛋白质组学研究的科学意义自学第六十一页，共118页。蛋白质结构与功能的关系第三节The Relation of Structure and Function of Protein第六十二页，共118页。一、蛋白质一级结构是基础二、蛋白质功能依赖特定空间结构第六十三页，共118页。（一）一级结构是空间构象的基础一、一级结构是基础牛核糖核酸酶的一级结构二硫键第六十四页，共118

24、页。（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能胰岛素氨基酸残基序号A5A6A10B30人ThrSerIleThr猪ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla马ThrSerIleAla第六十五页，共118页。（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。 第六十六页，共118页。（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病例：镰刀形红细胞贫血（常染色体隐性遗传）N-val his leu thr

25、pro glu glu C(146)HbS 肽链HbA 肽链N-val his leu thr pro val glu C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。第六十七页，共118页。肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基血红素结构 二、蛋白质的功能依赖特定空间结构（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似第六十八页，共118页。肌红蛋白(myoglobin, Mb) 肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构（AH）。血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基

26、与蛋白质部分稳定结合。 第六十九页，共118页。第七十页，共118页。血红蛋白 (hemoglobin, Hb)血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。 第七十一页，共118页。Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白亚基构象变化可影响与氧结合1分子Hb可以结合4分子O2。 正常人体动脉血的血氧饱和度为98% ，静脉血为75%。HbO2呈鲜红色，去氧Hb呈紫蓝色，当体表表浅毛细血管床血液中去氧Hb

27、 含量达5g/100ml血液以上时，皮肤、粘膜呈浅蓝色，称为紫绀。 第七十二页，共118页。氧解离曲线血红蛋白 (Hb)肌红蛋白 (Mb)第七十三页，共118页。协同效应 (cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)；如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity)。第七十四页，共118页。第七十五页，共118页。血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动

28、。第七十六页，共118页。别构效应 (allosteric effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应。第七十七页，共118页。（三）蛋白质构象改变可引起疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。第七十八页，共118页。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、 亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第七十九页，共118页。疯牛病是由朊病毒蛋白 (pr

29、ion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。疯牛病中的蛋白质构象改变第八十页，共118页。PrPc-螺旋PrPsc-折叠正常疯牛病第八十一页，共118页。第四节蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein第八十二页，共118页。一、蛋白质的两性电离性质二、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的变性四、蛋白质的特征性吸收峰五、蛋白质呈色反应第八十三页，共118页。一、蛋白质的两性电离性质蛋白质分子除两端的氨

30、基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点 (isoelectric point, pI)第八十四页，共118页。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI兼性离子 阳离子阴离子pHpI，想象成将氨基酸扔入NaOH中NH3+COO-NH3+COOHNH2COO-NH2COOH第八十五页，共118页。二、蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万kD，其分子的直径可达

31、1100nm，为胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷 水化膜第八十六页，共118页。+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉第八十七页，共118页。三、蛋白质的变性在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。蛋白质的变性 (denaturation)第八十八页，共118页。造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质：破坏非共价键

32、和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。应用：临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性是有效保存蛋白质制剂的必要条件。 第八十九页，共118页。天然状态有催化活性尿素-巯基乙醇去除尿素-巯基乙醇非折叠状态无活性若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性 (renaturation)。第九十页，共118页。在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 蛋白质沉淀蛋白质的凝固

33、作用 (protein coagulation)第九十一页，共118页。四、蛋白质的紫外吸收峰由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。第九十二页，共118页。蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。五、蛋白质呈色反应茚三酮反应 (ninhydrin reaction)双缩脲反应 (biuret reaction)第九十三页，共118页。测定蛋白质含量的方法1、凯

34、氏定氮法2、紫外吸收法（280nm）3、呈色反应第九十四页，共118页。第五节蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein第九十五页，共118页。一、透析及超滤法二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀三、电泳法四、层析分离五、超速离心分离六、分析多肽链的氨基酸序列七、蛋白质空间结构测定第九十六页，共118页。一、透析及超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。透析 (dialysis)超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。自学第

35、九十七页，共118页。二、蛋白质沉淀方法使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析 (salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 自学第九十八页，共118页。免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 自学第九十九页，共118页。三、电泳法分离蛋白质蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带

36、电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳(electrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 第一百页，共118页。电 泳 pI Mr.(kD)pI=4.2 80pI=4.7 40pI=4.7 15pI=4.7 40pI=6.9 70pH=8.6+-第一百零一页，共118页。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。几种重要的蛋白质电泳第一百零二页，共118页。等点聚焦电泳 (IEF)pI4.24.76.48.79.9+-pH14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1第一百零三页，共118页。双向电泳第一百零四页，共118页。四、蛋白质的层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少