液相色谱常见问题及其对策解析

1、欢迎参加岛津液相色谱维修培训班北京办事处海办事处费电话 800-810-0439 400-650-0439维修部税库ttp:/色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分 色谱法(Chromatography)：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相色谱定义液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱

2、分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力 液相色谱液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理采用 “HPLC” 级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择水的选择水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长 (nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1 专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。2 去离子水重蒸

3、；3 二次或三次重蒸水；4 采用类似家用的纯水机；5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 有机溶剂的选择溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱有机溶剂的选择甲醇 乙睛 正己烷分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图水 / 甲醇梯度ODS 柱鬼峰Gradient Curve总流速1 ml/min, 在10分钟之内甲醇比例由0升到100%，维持10分钟溶 剂 等 级鬼峰的

4、出现缓冲液的选择 选择缓冲液的步骤 1 .确定最佳分离状态时的流动相pH 2 .选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液 （即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液） 3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 （在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液）一些代表性弱酸的pKa pK1 pK2 pK3 醋酸 4.87 柠檬酸 3.13 4.76 6.40 磷酸 2.16 7.2 1 12.32缓冲液的选择缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞: 第二天接着用：用20%甲醇：80%水冲洗20-30分钟 隔几天再用：用甲醇：水冲洗后，再用纯甲醇

5、冲洗易受到细菌和霉菌的影响 不能直接用有机溶剂冲洗流动相的过滤 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动流动相的脱气脱气的方法1. 超声波脱气法2. 减压脱气法3. 使用氟树脂膜的减压脱气法使用氟树脂膜的减压脱气法

6、氟树脂膜真空室往送液泵真空泵控制器流动相梯度洗脱法梯度洗脱装置：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度混合器低压梯度比例阀 高压梯度低压梯度脱气机高压/低压梯度系统梯度洗脱法的注意点溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）查看空白实验的数据。遵守分析周期。（最初的分析

7、数据不采用）液相色谱流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器手动进样器检测器管线材料材料 不锈钢 Teflon PEEK (聚醚酮)尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.管线材料不锈钢 (可用于所有连接)能承受几千 kg/cm2 压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时)PEEK (可用于所有连接)能承受高达 250 kg/cm2压力可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon (用于柱后阻

8、尼管、反应管和排液管)化学惰性大能承受 5 kgf/cm2 压力材料：不锈钢烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用520的稀硝酸，超声波清洗， 再用蒸馏水清洗注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断吸滤头 LC-10ADvp LC-10ATvp岛津VP系列输液泵LC-20AT岛津LC-20A系列输液泵LC-20ADCheck valves for Pump BCheck valves for Pump ALC-20AB输液泵柱塞往复泵单向阀马达和凸轮柱塞杆柱塞杆密封圈泵头10 -100uL柱塞往复泵优点压力脉动小易于更换溶剂缺点需要更换柱塞杆密封圈LC-10ATvp泵：串联

9、 式往复泵LC-10ADvp泵：并联式 往复泵液相色谱输液泵液相色谱输液泵单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头流动相单向阀原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头输液泵容易出问题的部件故障1：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压， 使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中， 用超声波清洗单向阀输液泵容易出问题的部件故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好表现：系统压力波动大措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超 声波清洗单向阀故障：密封圈磨损而导致 密封不良现象：系统压力波动大或 漏夜措施

10、：更换密封圈注意点：1）更换前，新密封圈用异丙醇 浸泡15 min2）拆卸泵头前，柱塞杆复位（PSET）柱塞密封圈流动相泵头清洗管路柱塞杆密封圈输液泵容易出问题的部件故障：堵塞现象：系统压力波动大或压 力偏高措施：5稀硝酸，超声波清 洗判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm2，则可能堵塞。线路过滤器排液阀压力传感器线路过滤器流动相输液泵容易出问题的部件进样器自动进样器手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入手动进样器的原理图 装填状态进样状态进样器进样量和检测器响应的关系示意图进样体积 检测器响应值定量环体积的一半3倍定量环

11、体积全量注入部分注入部分注入和全量注入部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20l的定量环最多进样10l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。交叉污染的原因便捷的方法（不需清洗） 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态手动进样法1）进样应使用液相色谱专用平头 进样针2）进样时，进样针应插到底3）转动手柄时应尽快，不要停留在中途4）不使用时将针头留在进样器内5）样品溶液pH小于10, 常

12、用密封垫的材质适用pH10, 否则换特氟隆材质的密封垫pH10-136）分析结束后冲洗进样口，清洗应使用专用针口清洗器手动进样器定子转子塑料箍弹簧不锈钢套手动进样器操作注意点清洗针口手动进样阀 故障：转子密封损坏 现象：漏液 原因：a 拧的太紧 b 样品太脏 c 针头损坏或不使用液相专用针 解决措施：更换转子密封手动进样阀容易出问题的部件手动进样阀容易出问题的部件手动进样阀 故障：载样困难 原因：a 定量环堵塞 b 进样器污染 解决措施：清洗或更换定量环、进样器柱温箱的作用分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性 硅胶基底聚合物基底pH 范围2 - 7.5宽范围有机溶剂所有有限制压力 2

13、50 kgf/cm2低压温度宽范围60C色谱柱的类型及适用范围液相色谱柱在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样处理定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品，使用预柱5、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯7、避免流动相组成及极性的剧烈变化8、避免压力脉冲的剧烈变化液相色谱 柱的维护柱压低于150kgf/cm2柱温在40左右，最高使用温度为50缓冲液PH使用范围为27.5流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快硅胶在PH为34时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低

14、，硅胶越稳定。ODS柱的使用注意点：液相色谱柱的维护色谱柱的故障滤片或填料堵塞样品或流动相中杂质吸附机械振动产生空隙填料变性滤片或填料堵塞使用预柱缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤样品溶液使用0.45um滤膜过滤反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液打开柱头，清洗或更换滤片样品或流动相中杂质吸附杂质会产生拖尾峰仅 1 cm深度会被污染色谱柱取出污染填料，装填新的填料柱的补修填料的取出柱的补修恢复例柱的补修机械振动产生空隙不要撞击色谱柱如 色谱柱掉落或柱压急剧变化 。8945612370 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx000 0000 0LC-10A

15、D :输液时不要打开排液阀Back反相色谱分析时添加10-30 mM 三乙胺(triethylamine) 可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾添加1% 醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾三乙胺(triethylamine) 也用于正相色谱中,使硅胶部分去活性, 以获得化合物合适的保留时间注意事项紫外可见检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：Lambert-Beer定律，AKCL优点：1）对温度和流速变化不敏感 2）可用于梯度分析缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外可见检测器样品池参比池光电管光电管EinEinEin光栅D2 / W 灯lEout紫外可见检测

16、器参比池样品池光线光电倍增管紫外可见检测器岛津VP系列紫外检测器功能1）设定时间程序（波长切换等）2）双波长检测3）比例色谱，初步判断峰的纯度4）停泵扫描，确定组分最大吸收波长波长切换双波长检测比例色谱280nm220 nmratio280/220波长扫描更换氘灯（紫外检测器） 判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如 能量低于800，需更换氘灯。 操作注意点： 不要用手直接接触氘灯表面紫外检测器容易出问题的部件紫外检测器容易出问题的部件故障：样品池受污表现：样品池和参比池能量相差较大检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则

17、样品池受污。措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理液相色谱常见问题及其对策液相色谱常见问题类型 A. 压力异常（偏高、波动） B. 漏液 C. 保留时间漂移 D. 基线问题（漂移、噪声） E. 峰形异常现象：无压力，流动相不流动可能原因 1、保险丝断或电源问题 2、柱塞杆折断 3、泵头内有空气或流动相不足 4、单向阀损坏 5、漏液 6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)压力异常现象：压力持续偏高或不断上升 1、流速设定过高 2、保护柱或柱子筛板堵塞 3、流动相使用不当或有缓冲

18、盐析出 4、色谱柱选择不当 5、进样阀损坏 6、线路过滤器堵塞压力异常现象：压力持续偏低 1、流速设定过低 2、色谱柱选择不当 3、柱温过高 4、系统漏液压力异常压力异常现象：压力波动可能原因 1、泵头中有气泡 2、单向阀损坏 3、柱塞密封圈损坏 4、脱气不充分 5、系统漏液 6、使用了梯度洗脱漏液接头处漏液 1、接头处松动 2、接头磨损 3、接头被污染 4、部件不匹配 漏液泵漏液 1、单向阀松动 2、泵密封损坏 3、放空阀损坏 4、接头松动（不要拧的太紧）进样阀漏液 可能原因 1、转子密封损坏 2、定量环堵塞 3、进样口密封松动 4、进样针尺寸不合适 5、废液管产生虹吸 6、废液管堵塞漏液检测器漏液 可能原因 1、流通池垫片损坏 2、流通池透镜破碎 3、手紧接头处漏液 4、废液管堵塞 5、流通池堵塞漏液保留时间漂移 可能原因 1、柱温变化 2、流动相组分变化 3、色谱柱没有平衡 4、流速变化 5、泵中有气泡 6、流动相选择不当 7、键合相流失 8、缓冲容量不够保留时间漂移基线漂移 可能原因 1、温度波动 2、流动相不均匀(脱气，使