普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色

1、普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色第1页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四内容提要：实验1、观察制备好的装片 ；实验2、每个同学自己动手单染三张片子进行观察 ；第2页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四一、实验目的： 1.学习普通光学显微镜的构造和功能；2.学习并掌握油镜的原理和使用方法；3.学习微生物的简单染色，观察细菌的 形态。 返回第3页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四二、实验材料： 显微镜 载玻片 香柏油 擦镜纸 双层瓶 染色剂 滴管 菌液 返回第4页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四三、显微镜的构造：

2、 1、机械系统 （ P15图1）：A）单筒显微镜： 第5页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四B）双筒显微镜 第6页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四C)倒置显微镜 第7页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四显微镜的发展历史（补充内容）： = = R.虎克在17世纪中期 19世纪中期的显微镜 20世纪初期制做的复式显微镜 的显微镜 第8页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四续上： 带自动照相机 装有场发射枪的 超高压透射 的光学显微镜 扫描电子显微镜 电子显微镜 = = 第9页，共19页，2022年，5月20日，1点24

3、分，星期四2、光学系统 （P15图1）在光学系统中 ，物镜的性能最为关键，分为低、高、油镜头。油镜的放大倍数最大，在使用时比较特殊，需要在载玻片与镜头之间加滴镜油香柏油。 返回第10页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四四、油镜的原理： 放大倍数可100倍之大，焦距很短，光强度最大。 油=1.52（香柏油）介质折射率 水=1.33 空气=1 玻璃=1.55香柏油对光的折射率与玻璃相似，光线直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不但增加了照明度，而且使油镜的数值孔径增加，用NA表示，一般在1.21.4。低高倍镜头等干镜NA都低于1.0。若以可见光的平均波长为0.55m来计算，数值

4、孔径通常在0.65的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4m的物体而油镜的分辨率却可达到0.2m左右。可见显微镜的放大效能是由数值孔径决定的。第11页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四 什么是数值孔径？ 从物理学角度来看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制。 可表示为： 分辨率（最大可分辨距离）= /2NA =光波波长 ，NA=数值孔径值（可见光波0.4 0.7m） NA=n*Sina 1.光线投射到物镜上的最大角度的数值孔径值 一半正弦； 2.乘上玻片与物镜间介质折射率积。 n介质折射率， a最大折射角的半数 光线投射到物镜的角度愈大，分辨效能就愈大。物镜的分

5、辨孔径愈大，光波波长愈短，明显的增强分辨率如油镜。 返回第12页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四五、实验任务： 1、观察制备好的装片；2、每个同学自己动手单染三张片子进行观察。其中老师检查一片。 返回第13页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四六、试验步骤1、涂片左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧,冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片上做一涂膜;从固体斜面或平板上取菌时,用无菌接种环取少量菌体,涂抹均匀于预先滴有的一滴自来水地玻片上; 第14页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四2、干燥在空气中自然干燥或在火焰快速通过干燥(与热

6、固定同步进行).3、热固定用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续通过几次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜.第15页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四4、染色在固定的标本上加美兰（结晶紫）染液1-2滴,染色1min,轻轻滴加水洗; 吸干, 加半滴水, 盖上盖玻片, 滴上半滴镜油油镜检。(到此实际上即为细菌普通染色)媒染：揭去盖玻片,吸干水, 滴加1-2滴革氏碘液媒染1min, 轻轻水洗,吸干。第16页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四5、洗脱滴加95%乙醇溶液(或30%丙酮乙醇脱色),轻轻摇动玻片至液滴无色,不要过分脱色(约30秒),立即轻轻滴加水洗;吸干。6、复染滴加蕃红染液复染3min,轻轻滴加水洗;吸干载玻片背面及标本周围水渍,滴上半滴水，盖上盖玻片,油镜镜检。 返回第17页，共19页，2022年，5月20日，1点24分，星期四七、实验报告要求： 1、根据观察的球，杆菌的观察实况画示意图，各一图。2、用油镜观察时，为什么要求载玻片上加香柏油？3、思考题(4)影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 每个同学将自己制片的观察结果，报告老师，经检查合格