研究生论文答辩

1、血清TLR7在类风湿性关节炎发病中的表达及意义Serum levels and significances of Toll-like receptor 7 in rheumatoid arthritis作 者：郑善翠指导老师：陆亚华苏州大学附属第三医院12345研究背景 材料与方法实验结果讨 论结 论类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA）的发病率在我国约为0.4，全球为0.5-1.0，其第一个5年致残率达30，平均缩短寿命57年，已成为一种严重威胁人类健康的疾病。 研究背景 研究背景类风湿性关节炎（RA）是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性关节软骨、骨

2、破坏为主要特征。自身免疫耐受等自身免疫性疾病遗传、环境、感染 关节滑膜炎软骨和骨破坏RARA发病的确切机制至今尚不清楚，既往研究报道，RA是由T、B淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。在此基础上产生了一些针对细胞因子的抑制剂和针对B细胞的单抗类药物，用于治疗RA，并取得了一定的疗效。 研究背景但至今尚无一种生物制剂能使ACR70（即治疗6个月后达美国风湿病学会ACR临床改善70%）的缓解率达到50%，并且这些生物制剂往往在终止治疗后不能维持疗效。此外，研究者发现在免疫缺陷的小鼠中仍然有滑膜成纤维样细胞的活化。这说明除了T、B细胞介导的炎症反应外，还有其他的途径参与了RA的发病过程。随着Toll样受体

3、（Toll-like receptors，TLRs）的发现，先天性免疫在RA等自身免疫性疾病发病机制中的作用越来越受到研究者的重视。TLRs是一类模式识别受体，通过识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），激活先天性免疫；TLRs信号还通过上调抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）表面共刺激分子及APC分泌的炎性细胞因子调节适应性免疫。 研究背景作为白介素-l受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族的I型跨膜蛋白， TLRs结构分为3部分：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外

4、结构域富含亮氨酸重复基序(1eucine-rich repeats，LRRs)，称为LRRs功能域，主要作用是识别病原体的特征结构PAMPs，该区域结构变异较大，可能与PAMPs存在变异有关。胞内结构域和哺乳类IL-1R的胞内结构非常相似，称为Toll/IL-1R(TIR)功能域，主要负责将获得的信号向下游传导。研究表明，TLRs过度表达，可激活过强的免疫反应，打破自身免疫耐受导致自身免疫性疾病发生。正常情况下，机体存在TLRs的负性调节，可以适时终止TLRs信号，避免过强的免疫反应。主要包括5种不同机制：可溶性的TLRs竞争相应配体，如可溶性TLR4、TLR2；通过跨膜负调节分子调节；利用细

5、胞内的负调控分子；下调TLRs的表达；诱导过强细胞的凋亡。多项研究表明， TLRs参与RA疾病的发生发展。（如TLR2、TLR3、TLR4）。研究背景RA滑膜炎症的持续与加重及单核细胞、淋巴细胞等炎细胞的浸润都依赖于血管床的存在。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是迄今为止最强的促血管生长因子，在体内的生物学效应是增加血管通透性和诱导血管形成。其过度表达与类风湿性关节炎的发病及病理变化有着密切联系。诱导新生血管形成123促进滑膜炎症形成与发展促进关节软骨和骨破坏近年来研究发现，Toll样受体（ Toll-like receptor

6、s，TLRs）可以诱导VEGF表达增加（如TLR3、TLR7），由此参与类风湿性关节炎的自身免疫反应过程。RA自身免疫炎症反应TLRs滑膜组织增生RA病理生理过程滑膜组织增生可诱导VEGF表达作为TLRs家族一员，TLR7主要表达于浆样树突状细胞（plasmacytoid predendritic cell，pDC）、巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等免疫细胞中。此外，TLR7在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和内皮细胞中也有一定水平的表达。TLR7不仅识别一些咪唑喹啉类似物和鸟苷酸衍生物，更为重要的是识别病毒ssRNA。国外研究报道，TLR7在类风湿性关节炎滑膜中有异常高表达，并与其他TLRs协同

7、作用，通过MyD88依赖的信号传导通路最终激活NF-B，诱导多种炎性细胞因子、粘附分子及趋化因子的异常表达，打破自身免疫耐受，最终导致RA的关节滑膜炎性病变。RA发病中，T、B淋巴细胞的激活需要细胞表面TLR7信号的介导。而过度表达的TLR7与IFN-等炎性细胞因子和核因子NF-B 的表达可以形成正反馈循环机制，共同参与RA疾病进展。国外报道，用低分子量的TLR7激动剂反复给予小鼠刺激，可上调白介素-1受体相关激酶（IRAK）和含有SH2结构域的肌醇-5磷酸酶（SHIP-1），这两种抑制TLRs信号传导的分子表达,并诱导机体对TLR7和其他MyD88依赖信号传导通路的TLRs低反应性甚至免疫耐

8、受，从而抑制RA自身免疫反应。研究表明：VEGF和细胞表面TLR7均参与RA发病过程。目前尚无报道的问题：血清TLR7与VEGF表达水平的相关性如何？血清TLR7在RA发病中的表达及意义如何？RA通过研究Toll样受体7（TLR7）在胶原诱导关节炎模型（CIA）鼠血清中的表达水平，及其与疾病活动相关性，初步探讨血清TLR7在类风湿性关节炎（RA）发病机制中的作用。 研究目的 材料与方法 B组：等量生理盐水注射21天C组：雷公藤多甙50mg/kg/d治疗21天取DBA小鼠A组：正常对照组模型等量生理盐水注射皮内注射弗氏完全佐剂，第21天予二次免疫 实验设计第二周开始记录各组关节红肿情况，并进行关

9、节炎指数评分(AI)造模后第42天进行取外周血，处死小鼠，取踝关节。对踝关节进行固定、脱钙、包埋，切片、HE染色，病理学观察。ELISA法检测血清TLR7、VEGF 1.分别比较血清TLR7、VEGF在正常对照组、模型组、雷公藤治疗组中的表达差异。 2.分析血清TLR7、VEGF与关节炎指数评分、关节病理评分、滑膜组织病理评分的相关性。 3.分析TLR7与VEGF在血清中表达水平的相关性。关节炎症指数评分关节病理评分滑膜组织病理评分CIA建立CIA模型关节取材、固定、脱钙、包埋、切片、HE染色、病理学观察血清学指标检测（TLR7、 VEGF）统计分析结果 实验步骤按2mg/ml将牛型胶原加入0

10、.1mol/l冰醋酸溶液中，4过夜。次日加入等体积完全弗氏佐剂充分乳化，得到终浓度1mg/ml的胶原乳剂。距小鼠尾根部2-3cm处给予皮内注射该乳剂（150ul/只），建立类风湿性关节炎鼠模型。将注射当日记为0天，第21天给予等剂量胶原乳剂加强免疫。酒精脱水（低-高浓） 二甲 苯透明透明脱水 染色染色 2 周脱钙24小时固定 10%甲醛 10%乙二胺四乙酸Your Text脱水 封片 冷却凝固包埋浸蜡浸蜡(60);包埋脱蜡至水 关节取材及处理标准品稀释和加样标本加样温育配液洗涤温育加酶洗涤显色终止测定 ELISA法测血清TLR7、VEGF统计学处理采用SPSS17.0统计软件包。计量资料用均数

11、标准差的形式表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，重复测量数据通过球性检验，采用双因素重复测量方差分析，变量间关系符合正态分布的采用直线相关性分析，不符合正态分布的采用Spearman秩相关分析，P0.05为差异有统计学意义。 数据的整理与统计分析初次免疫后14-18天，模型组小鼠开始出现足部及踝关节红肿。至21天，按评分标准衡量，进行造模的20只小鼠，均造模成功。二次免疫后，小鼠关节肿胀逐渐加重，以双侧后足踝关节最明显，关节局部皮肤充血，皮温增高，足垫增厚，小鼠摄食及活动减少，精神萎靡，体重增长缓慢甚至下降。第28天左右关节肿胀达高峰，严重的关节不能负重，少数出现红

12、斑和溃疡，之后关节红肿逐渐减轻。CIA模型注：A：小鼠左后肢无明显肿胀，单个关节炎症评分为0分。B：小鼠左前肢轻度红肿，单个关节炎症评分为1分。C：小鼠右后肢均为中度红肿，单个关节炎症评分为2分。D：小鼠左后足严重红肿，单个关节炎症评分为3分。注：模型组与雷公藤治疗组体重均有一过性降低趋势，分别考虑与严重的关节炎症和药物副作用有关；组间差异有统计学意义（P0.5）。各组小鼠体重观察记录注：正常对照组小鼠无明显关节红肿；与模型组相比，雷公藤治疗组小鼠在初次免疫3周后炎症消退较快,但仍有关节红肿，组间差异有统计学意义（P0.05）。各组关节炎症指数评分记录组别 只数不同时间阶段关节炎指数评分（AI

13、）3周4周5周6周正常对照组100000CIA模型组106.602.17.801.5a6.801.3b6.401.8aTW治疗组106.801.55.000.03.801.83.501.5时间 F=19.02 P0.01 时间*组间 F=5.56 P0.01 表1.各组小鼠关节炎指数评分（AI）记录注：与雷公藤（TW）治疗组比较，a P0.01；b P0.05。正常关节结构及滑膜组织。模型组-滑膜组织血管重度增生，炎症细胞弥漫分布。模型组-大量增生的滑膜组织和炎症细胞已严重侵蚀关节软骨和骨。雷公藤治疗组-血管增生及炎症细胞较模型组少，关节软骨和骨侵蚀破坏较模型组轻。注：模型组较正常对照组降低，

14、组间差异有统计学意义（P0.01, F=1.75）；雷公藤治疗组较模型组升高，组间差异有统计学意义（P0.05，F=1.04）。注：模型组较正常对照组升高，组间差异有统计学意义（P0.01, F=0.30）；雷公藤治疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义（P0.05，F=0.93）。注：模型组较正常对照组增高，组间差异有统计学意义（P0.01，F=16.33）；雷公藤治疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义。注：模型组较正常对照组增高，组间差异有统计学意义（P0.01，F=16.00）；雷公藤治疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义（P0.01，F=0.19）。注：模型组较正常对照组增高，组间

15、差异有统计学意义（P0.01，F=9.53）；雷公藤治疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义（P0.01，F=0.24）。图7（1）血清TLR7与关节炎指数评分相关性(r=-0.406, P0.05)图7（2）血清TLR7与关节病理评分相关性(r=-0.434, P0.05)图7（3）血清TLR7与滑膜组织病理评分相关性(r=-0.513, P0.01)图7（4）VEGF与关节炎指数评分相关性(r=0.529, P0.01)图7（5）VEGF与关节病理评分相关性(r=0.592, P0.01)图7（6）VEGF与关节滑膜组织病理评分相关性(r=0.578, P0.01)图7（7）血清TLR7与

16、VEGF浓度相关性(r=-0.520, P0.01)以往研究着眼于测定细胞表面TLR7的表达及其参与疾病发生的情况。据国外报道， Toll样受体7（TLR7）在RA关节滑膜组织中有过度表达，并可以诱导IFN-、IL-1、IL-18等炎性细胞因子及VEGF、IL-8等促血管形成因子的异常分泌。本实验主要从血清学角度探讨了TLR7在RA中的表达及意义。结果发现，CIA模型组血清TLR7异常低表达。模型组有严重的关节炎症和关节病理破坏，雷公藤治疗组较之减轻，组间差异有统计学意义。血清TLR7与关节炎症指数（AI）、关节病理评分及滑膜组织病理评分分别呈负相关。这一现象的出现，可能是病原入侵后，介导先天

17、性免疫的细胞表面TLR7过度表达，与之竞争配体的血清TLR7可能耗竭殆尽，难以抑制RA自身免疫反应的发生。随着雷公藤的有效治疗，血清TLR7表达可能随之上调，逐渐恢复免疫调控的相互制约状态，从而减缓RA炎症活动。或许由此可以推测，血清TLR7可能通过负性调节免疫反应机制参与RA的发生或延缓RA的发生，对RA的发展预后可能具有一定的调控作用，甚至有可能成为RA诊断和评估疗效的新指标。血清TLR7与VEGF呈负相关。而国外有报道，TLR7可以上调VEGF的表达。我们初步推测，血清TLR7可能对VEGF的表达有抑制作用，从而抑制或延缓类风湿关节炎的滑膜炎症和关节病理性破坏。血清TLR7在CIA模型组有异常低表达。初步推测，在RA关节滑膜组织增生、血管翳形成、炎症发生乃至关节软骨和骨的病理性破坏过程中，血清TLR7可能具有负性调