金黄色葡萄球菌检验与计数课件

1、金黄色葡萄球菌检验与计数金黄色葡萄球菌检验与计数概况葡萄球菌属微球菌科，本菌有个菌种，从人体上可检出个种。葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。概况葡萄球菌属微球菌科，本菌有个菌种，从人体上可检出个种。金黄色葡萄球菌的生物学特性形态与染色：金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形，直径，大小不一，平均直径约为。革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭毛、无芽胞。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。金黄色葡萄球菌的生物学特性形态与染色：培养特性：易培养，对营养要

2、求不高，在普通培养基中生长良好。需氧或兼性厌氧。最适生长温度，最适生长 。耐盐性强，在含的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。在普通营养琼脂平板上培养，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。培养特性：在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、 试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。金黄色葡萄球菌的酶金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热酶。这两种酶均与金

3、黄色葡萄球菌的致病性有关。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否则为无致病力的菌株。血浆凝固酶对热稳定，能抵抗甚至后，仍能保存大部分活性。耐热酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。该酶的最适为。金黄色葡萄球菌的酶金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热酶。这金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。近年报导表明，以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。肠毒素是一种可溶性蛋白

4、质，由单个无分枝的肽链组成。分子量约为左右。易溶于水，难溶于有机溶剂。金黄色葡萄球菌的肠毒素金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本耐热，经煮沸不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，一般烹调温度不能将其破坏。 的油中需才能被破坏。可引起急性胃肠炎。根据肠毒素的血清型，可分、（、）、 个型。型肠毒素引起的食物中毒较多，约占左右。其他依次为、和型。也有、等。耐热，经煮沸不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素型肠毒素毒力较强，摄入即可引起中毒；型毒力较弱摄入，才引起中毒。一般认为引起人中毒的最小剂量是。型肠毒素毒力较强，摄入即可引起中毒；型毒力较弱摄入

5、，才引金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌的检测程序检样() 生理盐水或磷酸盐缓冲液氯化钠肉汤或氯化钠胰酪胨大豆肉汤平板，血平板涂片染色观察溶血血浆凝固酶试验报告血平板， 平板或。肉汤和营养琼脂小斜面金黄色葡萄球菌的检测程序检样() 生理盐水或磷酸盐缓冲液氯增菌培养基氯化钠肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，除某些嗜高盐的海洋菌外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。胰酪胨大豆肉汤：含氯化钠达，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氢二钾和葡萄糖促进葡萄球菌的生长。增菌培养基氯化钠肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡样品

6、的稀释固体和半固体样品：称取样品至盛有 磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内， 均质，或放入盛有 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打，制成的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取样品至盛有磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成的样品匀液。 样品的稀释固体和半固体样品：称取样品至盛有 磷酸盐缓冲稀释液增菌与分离培养增菌培养：吸取上述样品匀液，接种于 氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基内，培养。金黄色葡萄球菌在氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 将上述培养物，分别划线接种到平板和血平板，血平板培养。平板培养或。 增

7、菌与分离培养增菌培养：吸取上述样品匀液，接种于 氯化钠肉汤分离培养基琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。分离培养基琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。长期保存的冷冻或干燥食品中所

8、分离的菌落比典型菌落所产生的黑色金黄色葡萄球菌空白培养基培养基 用途 测试菌株参考培养基控制方法判定标准特性反应生长率金黄色葡萄球菌；金黄色葡萄球菌 定量黑色灰色菌落带透明带选择性大肠埃希氏菌或 定性全部抑制特异性表皮葡萄球菌 定性黑色灰色菌落无透明带金黄色葡萄球菌空白培养基培养基 用途 测分离培养基血琼脂：是一种基础培养基，含有的脱纤维血(羊血或兔血)。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈溶血。金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的溶血环。分离培养基血琼脂：是一种基础培养基，含有的脱纤维血(羊血或兔金黄色葡

9、萄球菌的重要鉴定血浆凝固酶试验 试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面 ，产生凝固。金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。二者的抗原性不同。金黄色葡萄球菌的重要鉴定血浆凝固酶试验 试验原理：致病性的血浆凝固酶试验 挑取平板或血平板上可疑菌落个或以上，分别接种到 和营养琼脂小斜面，培养 。 取新鲜配置兔血浆，放入小试管中，再加入可疑菌落的培养物，振荡摇匀，置温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体

10、积的一半，判定为阳性结果。 血浆凝固酶试验 挑取平板或血平板上可疑菌落个或以上，分别接同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 ，培养，重复实验。 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对结果报告如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌 。报告在（）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。结果报告如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌 。影响血浆凝固酶试验的因素血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。用人血浆出现凝固的时间短，约的阳性菌在内出现凝固。用兔血浆内出现凝固的阳性菌株仅达，大部分菌株可在内出现凝

11、固。若被检菌为陈旧的培养物（超过），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。影响血浆凝固酶试验的因素血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔不能使用甘露醇氯化钠琼脂上的菌落做血浆凝固酶的实验，因所有高盐培养基都可以抑制蛋白的产生，造成假阴性结果。不要用力振摇试管，以免凝块振碎。实验必需设阳性(标准金黄色葡萄球菌)、阴性(白色葡萄球菌)、空白(肉汤)对照。玻片法只能检测结合凝固酶，而试管法可检测两种凝固酶。因此，两种试验所得结果可完全不同。玻片法只用于筛选。不能使用甘露醇氯化钠琼脂上的菌落做血浆凝固酶的实验，因所有高 金黄色葡萄球菌计数 金黄色葡萄球菌计数第一法 平板法第二法法第三法测试片法第

12、一法 平板法第一法:平板计数法第一法:平板计数法检验程序检样() 生理盐水或磷酸盐缓冲液倍稀释选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种平板计数及血浆酶试验报告检验程序检样() 生理盐水或磷酸盐缓冲液倍稀释选择三个连续样品的接种、培养与典型菌落的确认根据对样品污染状况的估计，选择个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取，以，接种量，分别加入三块平板，用棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。接种前应注意保持平板的干燥(可在的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置，如样液不易吸收，可将平板置培养后，再反转平板，倒置于培养箱培养。培养温度与时间：，。典型菌落确认：从

13、典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到和营养琼脂小斜面，培养后进行血浆凝固酶试验。样品的接种、培养与典型菌落的确认根据对样品污染状况的估计，选典型菌落计数与计算公式的应用计数范围要求：选择合计菌落数在的平板，计数典型菌落。典型菌落计数与计算公式的应用计数范围要求：选择合计菌落数在的公式一的使用范围：最低稀释度平板的菌落小于 ，计数该稀释度平板上的典型菌落；某一稀释度平板的菌落大于 且有典型菌落，但上一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；某一稀释度平板的菌落大于 且有典型菌落，且上一稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在 之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；

14、公式一的使用范围：公式一 :样品中金黄色葡萄球菌落数； :某一稀释度典型菌落的总数 ；:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数 ；:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数； :某一稀释度。 公式一 公式应用例一 公式一： 样品稀释度典型菌落数，用于做血浆凝固酶菌落数血浆凝固酶阳性菌落数高、低稀释度平板均有典型菌落，但其中高稀释度二平板的菌落数均不在之间，选择低稀释度的平板进行计数。公式应用例一 公式一： 样品稀释度典型 ：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和； ：稀释因子(第一稀释度)。公式二的使用范围：平板菌落数均在 之间。公式引用于 ()公式二 公式二公式应用例二 公式二： 样品稀释度

15、典型菌落数，用于做血浆凝固酶菌落数血浆凝固酶阳性菌落数所有稀释度平板合计菌落数均在间：公式应用例二 公式二： 样品稀释度典型菌落数，用结果报告单位：或者；若或者为，报告 ()。结果报告单位：或者；若或者为，报告或的出现。方便表的查找。注意要点法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。第三法测试片法第三法测试片法适用范围测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。适用范围测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。测试片法检验程序检样()稀释，匀质，倍系列稀释选择适宜稀释度的样品匀液，各取分别加入纸片判读没有菌落只有典型紫红色菌落将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌除典型紫红色菌落外其他颜色的菌落加入

16、确认反应片， ，培养有粉红色菌晕的菌落计数为金黄色葡萄球菌报告测试片法检验程序检样()稀释，匀质，倍系列稀释选择适宜稀释度第三法 测试片法金黄色葡萄球菌测试片，含具有显色功能、经改良的培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。金黄色葡萄球菌在测试片上生成为暗紫红色的菌落，可以直接完成鉴定和计数。第三法 测试片法金黄色葡萄球菌测试片，含具有显色功能、经改良金黄色葡萄球菌确认反应片金黄色葡萄球菌确认反应片含有显色剂和耐热去氧核糖核酸()，金黄色葡萄球菌可生产耐热酶，此酶与反应片上的显色剂反应，形成粉红色环。而其他细菌因不产生耐热酶没有该反应。但在葡萄球菌属中，猪葡萄球菌、中间葡萄球菌也会产生阳性反应。金黄色葡萄球菌确认反应片金黄色葡萄球菌确认反应片含有显色剂和计数与结果报告菌落计数: 到培养时间应立即计数，可目视、或用放大镜辅助计数；选取菌落数在之间的测试片作为计数标准。选择菌落数在之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于， 则计数稀释度最