齐鲁医学实验七聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白

1、实验六 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白质 指导教师刘建昌、池雪林2021/9/301一、目的1、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原理、操作方法。2、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。2021/9/302二、原理“不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（1）使用两种不同浓度的凝胶系统；（2）配制 两种凝胶的缓冲溶液成分及PH值不同；（3）配胶缓冲液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、PH值也不相同。在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是Tris-HCL，PH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，成胶的缓冲液是Tris

2、-HCL,PH8.9。电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，PH8.3。可见，凝胶浓度、成胶成分、PH值与电泳缓冲液系统各不相同，形成了一个不连续系统。2021/9/303在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动。当电极缓冲液（pH8.3）中的甘氨酸离子进入浓缩胶时，pH值降到接近于甘氨酸等电点（5.97），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质成分也进入浓缩胶，pH值的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的Tris-HCl中C

3、l离子则全部解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成：甘氨酸蛋白质溴酚蓝Cl离子的顺序。2021/9/304甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子Cl与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前导Cl离子区域。当到达前导Cl离子区域时因不缺少离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢下来，结果在甘氨酸和Cl离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小浓缩成层。蛋白质

4、样品浓缩了好几百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。2021/9/305当离子流继续向前，进入以pH8.9缓冲液配制的小孔胶时，蛋白质分子在小孔胶里遇到阻力，迁移率减慢，同时在pH8.9条件下，甘氨酸又充分解离，其带电量增加，消除了离子流缺失的现象，小分子的甘氨酸离子赶上了蛋白质。凝胶各部分恢复具有恒定的电场强度，蛋白质的分离完全按一般区带电泳方式进行。不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后，形成紧密地压缩层进入分离胶。蛋白质各成分预先分开且压缩成层，可以减少在电泳时由于自由扩散而造成的区带相互重叠，这样就是提高了电泳的分辨能力。 2021/9/306三、试剂及器材（1）制备两

5、种胶的贮存液：见操作。（2）电极缓冲溶液 取甘氨酸28.8g及Tris6g分别溶解后，加蒸馏水到1000ml，为pH8.5。用前稀释10倍。（3）染色液：0.25g考马氏亮蓝R250,加入454ml甲醇水溶液和46ml冰醋酸。（4）脱色液：75ml冰醋酸、875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。（5）凝胶电泳玻管：选内径56mm、外径78mm、长80100mm光滑均匀的玻璃管。（6）510ml注射器（7）10cm长注射器针头（7号）（8）100l微量取样器。（9）圆盘电泳槽（10）0.05%溴酚蓝 2021/9/307四、操作 1、凝胶柱的制备 将洗净烘干的玻璃管一端插入疫苗瓶的橡皮帽中，或用其他

6、材料将玻璃管一端封闭。将封闭的一端朝底垂直放于桌面支架上。按表6-1先配制分离胶，在50ml干燥小烧杯中按比例加入1、2号溶液及蒸馏水，放入干燥器中，用水泵或抽气机抽气至溶液中无气泡冒出为止。取出，加入新配制的过硫酸铵，用玻璃棒混匀，及时用皮头滴管吸取胶液灌入玻璃管内约6.5cm高。然后立即顺管壁加入510mm高的水层，以隔离空气加速凝胶的过程。待30min既凝聚成胶，此时胶与水之间形成一条明显的界线。倒出胶面上的水，也可用滤纸条吸干。 2021/9/308100ml溶液中的含量溶液混合比例1号1mol/L HClTrisTEMED用浓HCl调至pH8.948.0ml36.6g0.23ml分离

7、胶1号 1份2号 2份H2O 1份 （抽气）3号 4份凝胶浓度7.5%，pH8.92号AcrBis30.0g0.8g3号过硫酸铵0.3g100ml溶液中的含量溶液混合比例4号1mol/L HClTrisTEMED用浓HCl调至pH6.7约48.0ml5.98g0.46ml分离胶4号 1份5号 2份7号 4份 （抽气）6号 1份凝胶浓度2.5%，pH6.75号AcrBis10.0g2.5g6号核黄素4.0mg7号蔗糖40.0g2021/9/309按表6-1配制浓缩胶，在抽气后加入核黄素，混匀。先用部分胶液冲洗分离胶面，倒出，在立即灌入余下的浓缩胶约1cm高，再沿管壁加入缓缓加入蒸馏水约0.5cm

8、高度，放置约30分钟左右。此时可见浓缩胶呈一层明显的灰白色胶柱。除去水层，用电极缓冲液洗涤胶面，吸弃，再用电极缓冲液加满至管顶，即可上样电泳。2021/9/30102加样 取新鲜血清（动物或人）5l，加40%蔗糖5l和溴酚蓝5l，放置在干净的白瓷板孔中，混匀。用微量取样器吸取样品，让针头穿过胶面上的缓冲液，缓慢推动取样器，使样品慢慢落在胶面上。推动取样器时不宜过猛，以免样品和缓冲液混合。2021/9/30113电泳 将已加好样品的凝胶管，轻轻除去下端的皮塞或封闭物，将管插入圆盘电泳槽孔中，管要插得垂直。插好后加入少量电极缓冲液于槽中，检查是否漏水。如不漏水即可加足电极缓冲液，至少要淹没过凝胶管顶部。电泳槽下槽中也加入电极缓冲液，至少要淹没电极。然后接通电源，负极在上，正极在下。电泳初期电压控制在80V，待样品进入分离胶后，加大电压到160V，继续电泳。当指示剂到达距管底1cm处时停止电泳，关闭电源。2021/9/30124、剥胶 倒出电极缓冲液，取出凝胶玻璃管。用带长注射针头（10cm）的注射器吸满水，针头插入玻璃管壁与凝胶之间，边插入边推水，并使针头沿管壁转动，直到针头插到头。这样凝胶柱即可脱离玻璃管滑出。若仍不自动滑出，可用洗耳球轻轻把凝胶柱吹出。但不能用力过大，以免凝胶滑出过猛而断裂。2021/9/30135染色 将取出的凝胶柱放入大