血清学诊断技术课件

1、 鸡病血清学检验血清学诊断技术1 鸡病血清学检验血清学诊断技术1 一 原 理 许多病毒具有凝集动物红细胞的能力, 这种凝集能力可被相应的抗体所抑制, 故可用已知病毒检测相应的血凝抑制抗体 . 也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定.红细胞凝集抑制试验血清学诊断技术2 一 原 理 红细胞凝集抑制试验血清学诊断技术2 二 使用范围 新城疫、禽流感、减蛋综合征、鸡毒支原体、滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分离后的鉴定 血清学诊断技术3 二 使用范围血清学诊断技术3三 器材1.血凝板、2.微量移液器3.标准抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液血清学诊断技术4三 器

2、材血清学诊断技术4四 操作程序（一）0.5红细胞的准备 1.阿氏液(抗凝剂)的配制 葡萄糖1.866 柠檬酸钠0.8 柠檬酸0.055 氯化钠 0.418g 蒸馏水 100ml 混匀放入100 ml葡萄糖瓶内，10磅115度10分钟 高压灭菌。冷却后4保存备用。血清学诊断技术5四 操作程序血清学诊断技术52.采血 取健康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1份）注意:(1). 两只健康的鸡血混合; (2). 阿氏液的量要够血清学诊断技术62.采血 血清学诊断技术63. 红细胞悬液的配制： 将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将

3、沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤， 如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥加99毫升稀释液）。血清学诊断技术73. 红细胞悬液的配制：血清学诊断技术7(二)被检血清 将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 注意: 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。血清学诊断技术8(二)被检血清 血清学诊断技术8 (三） 血凝抗原效价测定 （操作量25ul）(1)抗原 一般以鸡新

4、城疫II系或Lasota系作为已知抗原。 来源: 1).购买: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作 成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4半年 不变。血清学诊断技术9 (三） 血凝抗原效价测定 （操作量25ul）血清学诊断 2) 自制:A. 用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原：B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释10倍，以0.1毫升接种于10日龄的鸡胚尿囊内;C. 凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心（2000转/分钟）15分钟，取上清液;D. 作HA试验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于

5、洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。 血清学诊断技术10 2) 自制:血清学诊断技术102.抗原血凝价的测定每种抗原做两排，结果取均值 1). 1-12孔加生理盐水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔，依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 所有孔加25ul 1红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟 血清学诊断技术112.抗原血凝价的测定血清学诊断技术11 6 新城疫病毒室温（1822）作用 30分; 禽流感病毒37作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢 新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱 7 结果判

6、定 1).完全凝集孔为终点 2).将血凝板成45角竖立观察 3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集 4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝集,此孔稀释倍数为1个工作单位血清学诊断技术12 6 新城疫病毒室温（1822）作用 30分;孔 号12345678910稀释倍数5102040801603206401280对照生理盐水（毫升）病毒液（毫升）4*12525252525252525252525252525252525(25)弃去生理盐水（毫升）252525252525252525250.5%红细胞液（毫升）25252525252525252525作用温度与时间混合均匀置1822作用456

7、0分钟，对照管出现结果时判定结果（举例）+-鸡新城疫红细胞凝集试验（HA试验） (过程图)血清学诊断技术13孔 号12345678910稀释倍数510204080注意 能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例，病毒病的HA效价为1：320。 血清学诊断技术14注意血清学诊断技术14 （四) 红细胞凝集抑制试验 1. 抗原准备（工作浓度的准备 ） 红细胞凝集抑制试验（HI试验）时，病毒抗原液25ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作成320/4=80倍稀释。 血清学诊断技术15 （四) 红细胞凝集抑制试验血清学诊断技术152 操作步骤 (1) 每孔

8、加25ul的稀释液: 第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次; 吸取25ul于第 2孔，以此类推倍比稀释至第11孔; 最后从第11孔取2 5ul弃去,第12孔为抗原对照;(3) 每孔加4单位抗原;室温下( 18-22)作用30分(4) 取1红细胞25ul加于各孔中(5) 将血凝板振荡1分钟(6) 室温作用30-45分钟（禽流感 37）观察结果(7) 结果判定 将血凝板呈45竖起观察 完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉,此孔为抑制终点.血清学诊断技术162 操作步骤 血清学诊断技术16鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（H试验） (过程图)孔 号12345678910稀释倍数对照生理盐水待检血清252525

9、2525252525252525252525252525(25)弃去4单位抗原252525252525252525250.5%红细胞液（毫升）25252525252525252525作用温度与时间混合均匀置18-22作用45-60分钟，对照管出现结果时判定结果放室温作用分钟单位：l血清学诊断技术17鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（H试验） (过程图)孔 3.结果报告(1).鸡的免疫临界水平。(2).鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价（log2） 的平均值表示的。(3).检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。(4).大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1%-0.5%

10、，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为 理想的抽样率应为2%。(5）.鸡群接种新城疫疫苗后，经2-3周测血清中的HI抗体效 价若提高2个滴度以上，表示免疫应答良好，疫苗接种 成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。血清学诊断技术18 3.结果报告血清学诊断技术18血清学诊断技术19血清学诊断技术19血清学诊断技术20血清学诊断技术20琼脂免疫扩散试验（AGP）血清学诊断技术21琼脂免疫扩散试验（AGP）血清学诊断技术21 一 原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向四周扩散,当抗原抗体扩散到适当比列处相结合,出现肉眼可见的沉淀线. 常用已知抗原检测相应的抗体血清学诊断技术22 一

11、 原理 血清学诊断技术22适用范围( 琼脂扩散试验适用)禽流感、传染性支气管炎传染性法氏囊病、传染性喉气管炎鸡痘、马立克氏病、传染性脑脊髓炎网状内皮组织增生症、病毒性关节炎多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。血清学诊断技术23适用范围血清学诊断技术23 三 器材琼脂扩散板（平皿）;打孔器、 移液器;0.01M PH 7.2 的磷酸缓冲液;琼脂粉（糖）血清学诊断技术24 三 器材琼脂扩散板（平皿）;打孔器、 移液器;0.0 四 操作程序（一）琼脂板制备 1 琼脂粉1g 磷酸盐缓冲液100ml 2 加热煮沸， 摇动烧瓶使琼脂粉溶解 3 加入8g氯化钠振荡烧瓶，使氯化钠溶解， 4 待琼脂稍凉不烫手，倒板厚度

12、为2.53mm 5 琼脂凝固后，将其倒置湿盒内，4保存备用血清学诊断技术25 四 操作程序血清学诊断技术25（二） 打孔 1 用打孔器按7孔梅花图案打孔 孔径为3mm-4mm,孔距为3mm 大平皿可打六组梅花孔 2 打孔后用7#针头挑出孔内琼脂 3 最后在酒精灯上烧烤封底 血清学诊断技术26（二） 打孔 血清学诊断技术26（三） 加样 1 中间孔加抗原 2 外周孔加血清 1、4 孔加阳性血清; 其他 孔加待检血清; 加样至满孔为止; 3 室温下放置1020分钟 使孔内液体扩散完毕或液面下降 4 将琼脂板倒置于湿盒内 37温箱内作用24-72小时观察结果血清学诊断技术27（三） 加样血清学诊断技

13、术27 五 结果判定 （一） 当阳性血清与抗原孔之间出现清晰沉淀线 证明实验成立 （二） 如果被检血清与抗原孔之间出现沉淀线 或阳 性血清的沉淀线向邻近被检血清孔内侧偏弯者，被检血清判为阳性 （三） 如果被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线;而且阳性血清孔沉淀线直向被检血清孔则被检血清判为阴性血清学诊断技术28 五 结果判定血清学诊断技术28血清学诊断技术29血清学诊断技术29血清学诊断技术30血清学诊断技术30血清学诊断技术31血清学诊断技术31血清学诊断技术32血清学诊断技术32血 清 平 板 凝 集 试 验 血清学诊断技术33血 清 平 板 凝 集 试 验 血清学一 原理 细菌性颗粒抗原与相

14、应的抗体结合,在适当的电解质参与下, 经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可见团快. 常用已知细菌性抗原检测相应的凝集抗体 凝集试验包括：试管凝集反应 、平板凝集反应全血平板凝集反应、血清平板凝集反应）.血清学诊断技术34一 原理血清学诊断技术34适用范围 鸡白痢、鸡伤寒 鸡毒支原体、滑液囊支原体 鸡副嗜血杆菌病（鸡传染性鼻炎）血清学诊断技术35适用范围血清学诊断技术35 三 器材 凝集抗原、阳性、阴性血清 被检血清，移液器（550ul） 载玻片，25灯箱血清学诊断技术36 三 器材血清学诊断技术36 四 操作程序 （一）准备 试验前20分钟自4冰箱取出抗原; 阴、阳性血清和被检血清; 使其达到

15、室温，并将抗原液振荡均匀 血清学诊断技术37 四 操作程序血清学诊断技术37（二）试验过程 1. 取抗原液25ul滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快速用牙签将血清与抗原混匀 4. 并涂布成 2cm大小的片状 5. 在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，观察有无凝集血清学诊断技术38（二）试验过程血清学诊断技术38 五 结果判定 2 分钟内出现明显凝集（背景透亮）为阳性;背景均匀一致呈混浊样，无凝集者为阴性. 阴性阳性鸡白痢沙门氏菌的平板凝集试验的观察血清学诊断技术39 五 结果判定阴性阳性鸡白痢沙门氏菌的平板凝集试验新城疫病毒、禽流感病毒的分离和鉴定血清学诊断技术40新城

16、疫病毒、禽流感病毒的分离和鉴定血清学诊断技术40 一 病料的采集和处理 活动物： 气管、喉头、呼吸道分泌物（拭子） 死动物 ： 肝、脾、肺等内脏用生理盐水（肉汤） （含双抗2000单位/ml） 制成12组织匀浆 4冰箱作用小时或过夜 转分 离心分钟 取上清液备用血清学诊断技术41 一 病料的采集和处理血清学诊断技术41 二 鸡胚接种 1 取9-11日龄SPF鸡胚，每个样接种5-10个鸡胚 2 取上述处理的上清液0.2ml 接种于鸡胚尿囊腔中 3 37培养4-7天 4 每天照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚 5 收集死胚及培养结束时的活胚 放4冰箱中冷却2小时以上（过夜） 6 收取尿囊液测定其HA

17、活性（效价） 阴性者需传代2次 血清学诊断技术42 二 鸡胚接种血清学诊断技 三 病毒鉴定 禽流感病毒与其他血清型的副粘病毒 以及某些细菌支原体也具有血凝性 可用相应特异阳性血清进行血凝抑制试验 或全血平板凝集抑制试验进行鉴定 新城疫血凝抑制试验禽流感 琼脂扩散试验不同血清型禽流感血凝抑制试验 血清学诊断技术43 三 病毒鉴定血清学诊断技术43 四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定（一） 鸡胚平均致死时间（MDT）（最小致死量） 1 将新鲜感染尿囊液进行101-109稀释 2 每个稀释度接种5枚911天 SPF鸡0.1ml/胚 3 置37培养。每日照蛋2次 4 连续观察7天，记录每个鸡胚死亡

18、时间 最小致死量为引起所有鸡胚死亡最大稀释度 MDT最小致死量引起鸡胚死亡平均时间 强 毒60小时 中等毒力61-90小时 低等毒力90小时血清学诊断技术44 四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定血清学诊断技术44 （二） 脑内致病指数（IICP） 1、取凝集价在24以上的新鲜感染尿囊液 用生理盐水10倍稀释； 2、脑内接种1日龄雏鸡（24-40小时） 10只， 每只0.05ml； 3、 每24小时观察一次，共观察8天； 4、 每天观察给鸡打分，正常鸡为0分； 病鸡为1分；死鸡为2分；鸡每天观察仍记录2分） IICP是每只鸡8天所有观察数值的平均数强毒力病毒ICPI为2，温和毒数为0 血清学

19、诊断技术45 （二） 脑内致病指数（IICP）血清学诊断技术45 (三） 静脉致病指数（IVPI） 1 将HA高于24的新鲜感染尿囊液 用生理盐水做10倍稀释 2 给10只6周龄SPF鸡静脉接种0.1ml 3 每天观察一次，共10天，每次观察记录正常鸡为0，病鸡1， 瘫痪鸡、有神经症状者为2， 死鸡记作3（死鸡以后每天仍记3） IVPI指每只鸡10天内观察值的平均数， 温和型和中等毒力者IVPI为0，强毒株为3血清学诊断技术46 (三） 静脉致病指数（IVPI）血清学诊断技术46禽脑脊髓炎病毒的分离和鉴定血清学诊断技术47禽脑脊髓炎病毒的分离和鉴定血清学诊断技术47 一 采样 （一） 取发病典型的雏鸡脑组织 （发病早期，不超过23天） 加含双抗的生理盐水制成1020悬液 （二） 4作用24小时， （三） 1500转离心30分钟，取上清液备用。血清学诊断技术48 血清学诊断技术48 二 鸡胚接种 1