分子生物学基本技术定稿

1、第一节 分子杂交Section 1 Molecular Hybridization第一页，共五十八页。一、核酸分子杂交 1. 核酸分子杂交基本原理核酸变性与复性 核酸变性(denaturation)：由于外界因素影响，使核酸分子的空间结构改变，并引起核酸理化性质和生物学功能发生改变的现象。其本质是维持核酸空间结构的氢键和/或碱基堆积力受到破坏。 核酸复性(renaturation)：变性核酸在适当条件下根据碱基配对原则重新恢复空间结构的过程。复性可使核酸的理化性质得到恢复。第二页，共五十八页。变性复性DNA的变性与复性第三页，共五十八页。 核酸变性因素： 加热 pH 有机溶剂(如乙醇、尿素、甲

2、酰胺、丙酰胺等)等 核酸复性因素： 核酸序列复杂程度：越简单复性越快 核酸片段的大小：越小复性越快 核酸浓度：浓度越高复性越快 离子强度：强度越高复性越快第四页，共五十八页。 增色效应(hyperchromic effect)：核酸变性时，由于碱基外露使260nm处的紫外吸收值增加，这种现象称为增色效应。反之，称为减色效应(hypochromic effect)。不同来源DNA热变性时的增色效应7080901001.01.21.4A260nm温度()肺炎球菌(38% G+C)大肠杆菌(52% G+C)粘质沙雷菌(58% G+C)草分枝杆菌(66% G+C)第五页，共五十八页。 熔解温度(mel

3、ting temperature，Tm)：指50 DNA双链变性时的温度，也称解链温度或变性温度。此时溶液的紫外吸收值达到最大值的一半。DNA的热变性变性比率( )501000758085温度()TmTm第六页，共五十八页。 影响Tm值的因素： DNA的均一性 均一DNA解链温度范围较不均一DNA窄 DNA中的G+C含量 Tm69.30.41x(G+C) x(G+C)为(G+C)的摩尔分数 溶剂的性质 离子强度低， Tm较低，且溶解温度范围窄第七页，共五十八页。 核酸分子杂交(hybridization)：两个不同来源、具有互补碱基序列的单链核酸分子形成双链核酸分子的过程。混合后复性核酸杂交杂

4、合双链第八页，共五十八页。 退火(annealing)：DNA在热变性后，经缓慢冷却，并将温度维持在一定范围 ( 一般比Tm低2530左右 )时，单链DNA可重新恢复双链结构。2. 核酸分子杂交中的探针(probe)(1) 核酸探针的概念 能与特定的靶分子(DNA或RNA)发生特异性结合的核酸分子。第九页，共五十八页。(2) 核酸探针的种类与应用 据探针的来源和性质：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及寡核苷酸探针。 探针应用原则：探针与被检测的目的核酸之间在核苷酸序列上要具有高度的特异性。 基因组DNA探针 根据实验目的选择基因组中的一段DNA序列，并将此DNA序列克隆至工程菌经扩增

5、后可获得大量探针。第十页，共五十八页。 cDNA探针 cDNA (complementary DNA)：以mRNA为模板，经逆转录产生的能与模板互补的DNA链。 cDNA 探针无内含子，尤适用于基因表达的检测。 RNA探针 通常利用体外转录体系，以cDNA为模板制备。 优点是探针为单链，具有很高的杂交效率。 缺点是RNA易于降解，标记方法复杂。第十一页，共五十八页。 寡核苷酸探针 在体外经人工合成的单链DNA分子，可与靶分子中的一段序列互补。(3) 核酸探针的标记 标记物 同位素标记物：32P、3H、35S、14C、125I、131I。 非放射性标记物：地高辛、生物素和荧光素。第十二页，共五十

6、八页。32P及35S标记的NTP结构图4LidUTP连接臂敏感性酯键地高辛甾醇半抗原Dig-dUTP第十三页，共五十八页。 . 用T4多核苷酸激酶进行末端标记 . 切口平移法 . 随机引物法 . 粘性末端法 . 聚合酶链反应(PCR)法 标记方法(4) 标记探针的检测 放射自显影技术 免疫法检测第十四页，共五十八页。3. 核酸杂交常用方法(1) Southern 杂交(Southern blotting) 也称Southern印迹，由E.M. Southern发明，本质 为DNA-DNA杂交，基本过程为：限制酶消化电泳强碱变性转膜杂交洗膜曝光或显色第十五页，共五十八页。重物吸水纸膜凝胶塑料膜滤

7、纸缓冲液固相支持物杂交洗膜曝光Southern杂交图解限制酶消化凝胶电泳第十六页，共五十八页。植物限制酶消化图谱DNA第十七页，共五十八页。Dig标记探针的杂交结果第十八页，共五十八页。放射自显影照片第十九页，共五十八页。(2) Northern杂交(Northern blotting) 也称为Northern印迹，本质为利用DNA探针分析RNA样品，基本过程为：分离纯化RNA电泳转膜杂交洗膜曝光或显色变性第二十页，共五十八页。在生物芯片(biochip)中采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子有序地固化于支持物表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通

8、过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。此类技术又被统称为微阵列。(3) 微阵列(microarray)第二十一页，共五十八页。DNA微阵列实验流程图：阵列的制作(将确认后的序列自动印制在载玻片或膜上)靶标的制备(样品的提取与标记)杂交扫描检测结果分析DNA微阵列(芯片)的应用：新基因发现、基因诊断、药物筛选、个性化给药第二十二页，共五十八页。酵母在孢子形成期基因表达分析第二十三页，共五十八页。(4) 原位杂交 (in situ hybridization) 在细胞和组织内的原始位置进行杂交检测，靶序列无需分离或纯化。 包括染色体原位杂交和组织原

9、位杂交两类。 通常用于定位胞浆内mRNA，分析基因表达。 基本步骤：组织切片杂交洗涤显微观察第二十四页，共五十八页。 染色体原位杂交是在染色体上定位基因或DNA序列：染色体显微片(干燥)除RNA和蛋白质变性DNA洗涤观察分析杂交第二十五页，共五十八页。4. 核酸分子杂交的应用： 核酸杂交遵循碱基配对原则，决定了核酸杂交的特异性；此外核酸杂交可以在DNA与DNA、DNA与RNA及RNA与RNA之间进行， (1) 基因表达检测 (2) 从基因组文库或cDNA文库中筛选特定克隆 (3)基因在染色体中的定位 (4) 疾病诊断等第二十六页，共五十八页。二、其它分子杂交技术 1. 蛋白质印迹(Wester

10、n blotting) 又称免疫印迹(immunoblotting)，其原理是抗原抗体的特异性结合。 基本步骤：电泳分离蛋白样品电转膜与一抗反应与二抗反应显色反应第二十七页，共五十八页。 二抗可用酶、生物素或荧光物质进行标记。 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)： 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高度特异性试验分析技术。第二十八页，共五十八页。2. 凝胶滞留法(gel retardation assay) 又叫迁移率改变法(mobility shift assay)，是检测 DNA结合蛋白的一

11、种简单灵敏的方法。 基本原理：蛋白质可与DNA形成复合物，在进行PAGE电泳检测时，这些复合物比游离的DNA慢很多形成一个滞后带。第二十九页，共五十八页。第 二 节 聚合酶链反应(PCR) Section 2 Polymerase Chain Reaction第三十页，共五十八页。一、PCR基本原理 是在热稳定DNA聚合酶催化下的体外DNA合成的循环反应。 PCR反应体系：DNA模板、热稳定性DNA聚合酶、引物、四种dNTP和Mg2。 PCR反应三个基本过程： (1) 变性：利用高温(95)使双链解开。 (2) 退火：在低温(2565)下使引物与模板配对。 (3) 延伸：在72利用热稳定DNA

12、聚合酶催化DNA合成。第三十一页，共五十八页。模板DNA引物dNTPTaq DNA Pol变性退火延伸PCR循环第三十二页，共五十八页。 PCR反应三个基本过程可以不断循环，从而使体系内DNA的量呈指数增长。变性退火延伸变性退火延伸循环1循环2经过多轮PCR第三十三页，共五十八页。二、PCR反应试剂1. 模板 (1) 模板DNA用量少，一般使用102105拷贝 (2) 有一定的纯度要求 (3) 对模板的序列有一定了解2. 引物 引物为一段寡核苷酸序列。 每条引物的典型浓度约0.10.5mol/L第三十四页，共五十八页。 引物设计一般原则： (1) 为待扩增序列两端的已知序列 (2) 长度一般为

13、18-30个寡核苷酸 (3) G+C含量合理：4060%，Tm4(G+C)2(A+T) (4) 在3末端避免富含G或C (5) 避免引物二聚体的形成 (6) 避免引物形成发夹结构 (7) 在5端可引入限制位点第三十五页，共五十八页。3. DNA聚合酶 热稳定性DNA聚合酶，从嗜热菌可获得。 聚合酶的选择以实验目的为依据常用热稳定性DNA聚合酶酶最佳温度()外切酶活性保真度Taq758053低Tfl70低Pfu727835 高Deep Vent708035 高Pwo606535高 聚合酶的浓度通常为22.5U/100l。第三十六页，共五十八页。4. dNTP 高浓度的dNTP对扩增反应具有抑制作

14、用，甚至引起 聚合酶的错配，一般将浓度控制在200mol/L左右。5. Mg2 Mg2浓度高会引起非特异性产物增加，Mg2浓度低， 会使聚合酶活性降低，一般控制在0.52.5mmol/L第三十七页，共五十八页。6. pH缓冲体系 标准PCR体系常使用10mmol/L的Tris-HCl(pH8.3-8.8) 缓冲体系，反应时由于温度升高体系的pH值可回落 至7.2左右。7. 一价阳离子 标准PCR体系常使用50mM的KCl，对于扩增500bp 以上的片段有利，调整至70100mmol/L时，对扩增 较短片段有利。第三十八页，共五十八页。三、PCR循环1. 标准PCR循环 包括变性、退火和延伸三步

15、：变性：94-96退火：55-65延伸：72重复2535次第三十九页，共五十八页。2. PCR循环效率 与聚合酶活力直接相关： Nf N0 (1+Y)n Nf为n次循环后的扩增序列拷贝数 N0为靶序列的起始拷贝数 Y为扩增效率，n为循环数 若Y100，则： Nf N0 2n 当靶序列拷贝数达1012时，聚合酶成为扩增限制 性因素第四十页，共五十八页。1. 目的基因的克隆2. 基因的体外突变3. DNA和RNA的微量分析4. DNA序列测定5. 基因突变分析四、PCR的主要应用第四十一页，共五十八页。五、反转录PCR (Reverse transcription PCR，RT-PCR)1. RT

16、-PCR过程以RNA为模板，经逆转录产生cDNA链，并用以进行常规PCR。RNA cDNA dsDNA PCR第四十二页，共五十八页。正义引物更多PCR循环RNARNARNADNADNADNADNA反义引物第四十三页，共五十八页。2. RT-PCR的应用(1) 定量分析mRNA，测定基因表达强度(2) 构建大容量的cDNA文库(3) 鉴定已转录序列是否已经发生突变第四十四页，共五十八页。六、 实时定量PCR (real time PCR) 使用荧光试剂标记PCR产物，可对模板量(基因拷贝数)和PCR产物进行定量分析，具有很好的可靠性。 实时定量PCR包括两种： (1) 通过插入荧光染料进行定量

17、，如SYBR Green (2) 利用荧光标记的寡核苷酸探针进行定量，如 TaqMan探针第四十五页，共五十八页。SYBR与 dsDNA 结合，在受到激发时，可发出绿色荧光。第四十六页，共五十八页。第四十七页，共五十八页。第四十八页，共五十八页。第四十九页，共五十八页。第三节 DNA测序Section 3 DNA Sequencing第五十页，共五十八页。一、双脱氧链终止法 (Dideoxy Chain Termination Method) 双脱氧链终止法由Fred Sanger (1977) 所发明。 原理：在DNA聚合反应体系中加入ddNTP，使DNA的聚合进程随机终止，通过PAGE分析

18、，直接读出DNA序列。 双脱氧链终止法反应体系组成：DNA模板(即待测序DNA)、DNA聚合酶、测序引物和dNTP(ddNTP和标记dNTP)。双脱氧链末端终止法(F. Sanger，1977)和化学裂解法(Maxam和Gilbert，1977)。第五十一页，共五十八页。ddNTPdNTPdNTP与ddNTP的结构第五十二页，共五十八页。ATGCDNADNA PoldNTP(dNTP*)测序引物*ddATPddTTPddGTPddCTP3GATTCCGACCTAGTC5CTAAGCTAAGGCTGGACTAAGGCTGGATCA CTAAGGCTGGATCAGCTAAGGCTCTAAGGCTGGAT CTAAGGCTGGATCAGCTAAGGCTAAGGCTGCTAAGGCTGGCTAAGGCTGGATCAG(G)CTAAGGCCTAAGGCTGGATCCTAAGGCTGGATCAG第五十三页，共五十八页。CTAAGGCTGGATCACTAAGGCTGGATCCTAAGGCTGGATCTAAGG