分子发光荧光磷光以及化学发光

1、关于分子发光荧光磷光及化学发光1第1页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四3.光分析方法光分析法原子吸收法红外法原子发射法核磁法荧光磷光化学发光紫外可见法分子光谱原子光谱2第2页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四第六章 分子发光荧光、 磷光及化学发光Chapter SixFluorescence Phosphorescence and Chemiluminescence3第3页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四分子发光 荧光、磷光及化学发光 Fluorescence Phosphorescence and chemilumi

2、nescence6.1 分子发光的基本原理6.2 分子荧光和磷光的影响因素6.3 荧光（磷光）分光光度计6.荧光分析法的应用6.化学发光分析法4第4页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，

3、从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。6.1 分子发光的基本原理5第5页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四 分子光谱的产生1分子的能级210012 ,0 ,1 ,21J023J0231J0231J0231分子紫外吸收光谱分子可见吸收光谱分子红外吸收光谱分子光谱：连续光谱 带光谱远红外光谱中红外光谱紫外-可见光谱6第6页，共

4、105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫. 无辐射跃迁的类型振动弛豫: Vr 10-12sec外 转 移:无辐射跃迁回到基态内 转 移:S2S1能级之间有重叠系间窜跃: S2T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 S2. 辐射跃迁的类型共振荧光：10-12 sec荧 光：10-8 sec磷 光：1010-4 sec迟滞荧光:10210-4 sec7第7页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四. 单重态与三重态受激有机分子的电

5、子激发态可以归纳为两种状态：基态激发态单重态激发态三重态激发态平均寿命 10-8sec激发态平均寿命10-41 secS0S0S0S1T18第8页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四9第9页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫. 无辐射跃迁的类型振动弛豫: Vr 10-12sec外 转 移:无辐射跃迁回到基态内 转 移:S2S1能级之间有重叠系间窜跃: S2T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 S2. 辐射跃迁的

6、类型共振荧光：10-12 sec荧 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec迟滞荧光:10210-4 sec10第10页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四振动弛豫 当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层跃迁到激发态的较高的振动能层上去然而，在液相或压力足够高的气相中分子间碰撞的几率很大，激发态分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围的分子，而自身从高振动能层失活到该电子能级的最低振动能层上，这一过程称为振动弛豫发生振动弛豫的时间为10-12s数量级11第11页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四内转换 内转换指的是相同多重度等能态间的

7、一种无辐射跃迁过程当两个电子能级的振动能层间有重叠时，则可能发生电子由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子的激发态内转换过程在10-1310-11s时间内发生，它通常要比由高激发态直接发射光子的速度快得多 12第12页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四外转换 激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程称外转换这一现象称为“熄灭”或“猝灭”自较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换，也可包含内转换13第13页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四系间跨跃系间跨越指的是不同多重度状态间的一种无

8、辐射跃迁过程它涉及受激电子自旋状态的改变如S1到T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子能态的振动能层有较大的重叠时，如图中激发单重态S1的最低振动能层与激发三重态T1的较高振动能层重叠，则可能通过自旋轨道耦合等作用使S1态转入 T1态的某一振动能层 14第14页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四荧光、磷光发射从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛 豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在10-410s左右时间内 跃迁回基态而发生磷光由此可见，荧光与磷光的根本区别是：荧光是由第一电子激发单重态最低

9、振动 能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由第一电子激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的 15第15页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四16第16页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四17第17页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四1. 分子荧光与磷光的产生（1） 单重态与三重态（2） 分子的活化与去活化（3） 分子发光的类型按激发的模式分类： 按分子激发态的类型分类： 光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光 分子发光分子发光荧光磷光瞬时荧光迟滞荧光按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)

10、： ex em共振荧光(Resonance)： ex = em 荧光 18第18页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四2. 分子荧光(磷光)光谱(1) 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。a. 激发光谱固定em= 620nm(Max)ex = 290nm (Max)固定发射波长扫描激发波长荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似19第19页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四ex =290nm (MAX)固定em= 620nm(Max)固定ex= 290nm (Max)em= 620nm

11、(MAX)b. 发射光谱 (荧光光谱)固定激发波长 扫描发射波长c. 激发光谱与发射光谱的镜像关系S04321S14321发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1 41 31 2111 11 21 31 420第20页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四d. 磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光谱21第21页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四22第22

12、页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四23第23页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四（2）三维荧光光谱I F f (ex 、em)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长24第24页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四I F f (ex 、em)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长25第25页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四蒽的三维等高线光谱图 26第26页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四蒽的三维等荧光强度光谱27第27页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星

13、期四VB1和VB2的三维荧光光谱28第28页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四RLSDSTSATSADS散射片三维共振光散射光谱（3）三维共振光散射光谱ADSATSTSRLSDS散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射瑞利散射固定ex= 270nm拉曼光二级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间29第29页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四3. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系（1）荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert Beer Law）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：30第

14、30页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四对于稀溶液，当 bc0.05（磷光 bc1000F (s)2.62.51.40.230.0140.0023（6）溶剂效应蓝移: E n * E n * 红移: E* E* 在极性溶剂中：无溶剂化作用有溶剂化作用39第39页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四 金属螯合物的荧光（1） 螯合物中配位体的发光（2） 螯合物中金属离子的发光8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光2,2-二羟基偶氮苯无荧光2,2-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光T1系间窜跃S0S1d *、f* d * d f* f 荧光分

15、子内能量转移40第40页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四荧光的熄灭（1） 碰撞熄灭荧 光 熄 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。相对速率 1K1 M*K2 M* Q与分子的直径、粘度、温度等因素有关。（2） 能量转移熄灭再吸收过程：共振能量转移：分子内能量转移：hv激发发射熄灭41第41页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四（3） 氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂（4） 自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自

16、吸收：没有除氧，溶液中难以观察到磷光由于F 5s。还有一种慢发光，化学发光强度在一段时间基本保持不变，然后再较快的上升或下降。75第75页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四化学发光的动力学曲线76第76页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四设某分析物与过量试剂作用而发光，则此时的化学发光强度与分析物浓度有如下关系 式中，ICL(t)为在时刻t的化学发光强度，以每秒产生的光量子数表示，为化学发光效率，-dc/dt为分析物参加反应的速度，即每秒参加反应的分子数。(2)77第77页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四为了提高测量的灵

17、敏度，也可采用测量峰面积，即在一定时间间隔内对化学发光强度进行积分，得到发光强度的积分值：(3)78第78页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四此时，t1和t2若为反应过程中的某一段时间间隔，则积分值只是部分化学发光强度的积分值。如果t1取零，t2取反应结束所需时间，得到的就是整个反应产生的总发光强度。它相当于化学发光动力学曲线下的整个峰面积，它与分析物浓度存在线性关系。这种分析方法实质上是一种平衡法，特别适于慢的化学发光。79第79页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四当然，化学发光反应对指定的测定最好是专属的（如酶法化学发光），这样就勿需实行光学

18、分辨或化学方法排除干扰许多化学发光的强度与分析物质的浓度在几个数量级之内呈良好的线性关系 80第80页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四化学发光反应的类型（1） 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。表示如下：A + B C* + D C* C + hv式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*。当C*跃回激态时，辐射出光子。81第81页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四间接化学发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始激发态C*，C*不直接发光，而是将

19、其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃回基态时，产生发光如下式表示：A + B C* + D C* + F F* +E F* F + hv式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。例如，用罗丹明B没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3，其化学发光反应就属这一类型。82第82页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四没食子酸 + O3 A* + O2A* + 罗丹明B 罗丹明B* + B罗丹明B* 罗丹明B + hv没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射光子，该光

20、辐射的最大发射波长为584nm。83第83页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四气相化学发光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。NO与O3的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + hv（2） 气相化学发光和液相化学发光84第84页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四这个反应的发射光谱范围为666875nm，灵敏度可达1ng/ml。也可同时测定大气中NO2的含量，将NO2还原为NO，测定二者的总量，再减去NO的量。液相化学发

21、光的几种体系：鲁米诺、光泽精、过氧化草酸酯85第85页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四（3）异相化学发光和生物化学发光异相化学发光 如在含有罗丹明B和没食子酸的硅胶上，O3与没食子酸反应生成高能中间体A*，然后将能量转移给罗丹明B接受体而发光。该反应用于气球探测器或气相卫星上，以便测定大气或同温层的O3含量。86第86页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四生物化学发光 荧火虫素与三磷酸腺苷（ATP）反应，在萤火虫素酶（E）与Mg2+存在时生成萤火虫素与一磷酸腺苷（AMP）的复合物和焦磷酸镁，然后复合物与氧发生化学发光反应，CL接近于1。 该体系可

22、测定210-17molL-1的ATP，这相当于一个细菌的ATP含量，灵敏度很高，选择性很好。87第87页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四鲁米诺化学发光反应的机理在常用的化学发光分析的发光物质中，鲁米诺的应用最广泛。深入的研究已经给出鲁米诺化学发光反应机理的初步模式。它产生化学发光反应的CE为0.010.05。88第88页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四鲁米诺氧化发光原理 hv(max=425nm） 3-氨基苯二甲酰环肼89第89页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四鲁米诺（3-氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中可被一些氧化剂

23、氧化，产生最大发射波长为425nm的化学发光。发光过程有两种方式，即单电子氧化和双电子氧化，单电子氧化得到中间体鲁米诺游离基；双电子氧化得到中间体叠氮醌，而最后发光体是3-氨基邻苯二甲酸根阴离子。在碱性溶液中，I2与鲁米诺的化学发光反应属于双电子氧化过程，该化学发光体系可检测碘的浓度低达510-10molL-1。90第90页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四金属离子催化鲁米诺-H2O2体系的化学发光反应大都属于单电子氧化过程。例如： Mn+ + HO2-Mn+HO2- Mn+HO2-+鲁米诺H2OM(n+1)+鲁米诺游离基3OH- 鲁米诺游离基+HO2-化学发光上述历程

24、中Mn+（如Co2+）参与了反应，价态升高，本身是还原剂。91第91页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四液相化学发光的测量仪器大多数化学发光和生物发光测量仪器称为光度计，因为这类仪器只有光电检测，没有单色器提供光色散。也有人称这类仪器为发光光度计。商品名称则更为多种多样。液相化学发光的一个重要优点是仪器比较简单，一般仅有进样系统和检测系统组成 。92第92页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四化学发光仪示意图93第93页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四（1） 进样系统进样系统包括化学发光反应池、试样注射器、聚光和控温装置等

25、。保证试样能在反应池内均匀混合，产生的光辐射供检测系统检测。进样分静态注射和流动注射两种方式。试样反应池反应池的材料可根据不同要求选择玻璃、石英或塑料等，池的形状要与光电管的有效接受面积相匹配。若为流动分析则形状、大小都有严格要求。94第94页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四进样器在静态注射进样方式中，进样器通常为微量吸量管或各种形式的注射器，容积从微升到毫升不等。若为流动注射进样方式，用泵代替注射器或加有注射阀。95第95页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四聚光装置为了提高检测效率，通常在试样池的后方装一聚光装置。这种装置可以是凹面镜，简单的

26、也可用一平面镜，也可直接在池子外面半圆圈周上镀一个镜面，使化学反应的光辐射能有效地到达光电管接受面。好的聚光装置可使进入检测器的光达50%。96第96页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四进样方式在静态注射进样方式中，可以是反应物混合后最后注入分析物，也可以是分析物与介质混合后再注入反应物。应根据分析要求和反应体系特点，选择最佳进样程序。静态进样的优点在于反应条件容易选择且使用方便，仪器价格也较低廉。97第97页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四（2） 检测系统检测系统包括光电转换、信号放大、信号处理和数据显示等部分。光信号转换为电信号由光电倍增管来完成。对于某一特殊用途的仪器，仅要求检测器的光谱响应最大值与指定应用体系的化学发光光谱峰值相同或相近即可；对通用仪器，则管子光阴极的光谱响应范围越宽越好，以适应各种不同的发光体系。98第98页，共105页，2022年，5月20日，14点24分，星期四影响液相化学发光强度的主要因素 （1）溶液酸度不同的化学发光体系要求在不同的pH值下进行才能获得最大的发光强度。试液的酸度会影响发光活性物质的有效浓度，对化学光强度直接产生影响，所以反应液及试液的酸度对化学发光强度影响很大。每个发光体系的最