地龙ISSRPCR反应体系的建立与优化

1、地龙ISSR-PCR反响体系的创立与优化【摘要】目的创立和优化地龙ISSRPR反响体系。要领以地龙药材为实行试材，接纳异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板，对地龙ISSR-PR反响体系中各个重要影响因子举行了优化和筛眩结果创立了标识表记标帜位点清楚、不变、重复性好，可用于地龙ISSR阐发的最正确反响体系，50l体系中含有：1Taq酶配套缓冲液，DNA模板50ng，2.5UTaqDNA聚合酶，2lLgl2，0.8lL引物，0.2lLdNTPs。扩增步伐为：94预变性5in；94变性30s，据差异引物的退火温度复性30s，72延伸1.5in，共35个循环；72延伸5in，反响竣事后，4保存。结论这一

2、优化体系的创立为以后利用ISSR标识表记标帜技能举行地龙类药用动物断定及种质资源遗传多样性阐发奠基了基矗【关键词】地龙；ISSR；反响体系；创立和优化Keyrds:Earthr;InterSipleSequeneRepeat；Reatinsyste；Establishentandptiizatin地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretiaaspergillu(EPerrier)、普通环毛蚓Pheretiavulgarishen、威廉环毛蚓Pheretiaguilleli(ihaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretiapetiniferaihaelsen的枯燥体。前一种习称“广地龙，后三种习称“沪

3、地龙，为常用动物类中药，具有清热定惊、通络平喘、利尿的成果。地龙类药用原动物品种较多，如今生药断定所接纳的要领，大多仍相沿传统的经典分类要领，通过活体性状1大概粉末显微特性的不雅察2来区分。对付颠末炮制加工了的药材，由于失去其原天性状而难辨真伪，也有人实行用一些新技能和新要领来办理这一困难，如用X射线衍射Furier谱对广地龙药材粉末举行了断定新要领探究3,利用高效液相色谱法对地龙药材举行指纹图谱阐发4等。但这些要领并未被得到普及的利用，且存在结果的专属和可靠性等题目。简朴重复序列区间(inter-siplesequenerepeat,ISSR)是Zietkieiz5即是1994创立的一类在P

4、R反响底子上的DNA分子标识表记标帜技能，它是按照基因组内普及存在的微卫星序列方案的单一引物对基因组举行扩增的标识表记标帜体系，比年来该技能已敏捷应用于品种断定6、种质资源和遗传多样性7的研究，并作为构建遗传连锁图谱的东西8。ISSR技能与RAPD技能相似，其缺点是对差异引物、差异质料的扩增条件有异，PR扩增反响的最正确条件必要一按时间的探究。在扩增条件中，模板DNA的量、引物浓度、镁离子浓度和Taq酶的量、引物退火温度等都市影响ISSR扩增。本研究探究地龙ISSR-PR反响的优化条件，以期创立可用于地龙ISSRPR阐发的最正确反响体系和扩增步伐，为深化开展地龙类药用动物断定及种质资源遗传多样

5、性阐发奠基基矗1东西1.1仪器Eppendrf5410R型台式高速冷冻离心机；TaKaRaTP600梯度PR；凝胶电泳仪：北京六一仪器厂DYY-6型；凝胶图像阐发体系：英国UVP公司GDS7600；多成果酶标仪：TEANSpetraFLURplus。1.2质料TaqDNA聚合酶、dNTPs及2000bpDNALadderarker购自广州美津公司；ISSR引物按照加拿年老伦比亚大学(UB)宣布的序列，由上海生工生物工程公司合成，经开端挑选，确定UB834序列为AG8YT为此次试验的引物。药材浸泡液构成：10l/LTrisHl(pH8.0)，200l/LEDTA(pH8.0)，50l/LNal溶

6、液，灭菌后利用；DNA提取缓冲液构成：0.1l/LNal，10l/LTrisHl(pH8.0)，100l/LEDTA(pH8.0)，灭菌后利用。地龙药材由广东，福建、湖北、上海等地药材市场网络后，经广州中医药大学李薇传授断定，别离为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretiaaspergillu(EPerrier)和威廉环毛蚓Pheretiaguilleli(ihaelsen)的枯燥体，均属于?中国药典?2022年版部“地龙项下划定的品种。2要领2.1基因组DNA的提取和检测接纳异丙醇沉淀法，从地龙药材样品的表皮构造中提取总DNA。步调：剪取药材中段，去除腹部泥沙。纯水冲洗表里，保存在药材浸泡液中4，2

7、4h以上，弃去浸泡液，剪碎质料，放入玻璃匀浆器中，分2次1000，1000l参加共2000lDNA提取液于冰上匀浆至不见构造块状物，全部倒入5l塑料离心管中。参加10SDS200l,20g/l卵白酶K20l，充实混匀，放入5565水浴锅中温浴2h，每隔15in取出颠倒混匀。汲取800l于1.5lEP管中，参加600l饱和Na1，在旋涡混匀器上高速混淆30s，10000g离心30in，移上清到另一EP管中。参加等体积异丙醇，混匀，置201h，然后10000g离心20in，弃上清。沉淀参加70乙醇500l洗涤3次，枯燥后将其溶于100lTE中，经1琼脂糖凝胶电泳阐发，UVP凝胶成像阐发体系照相，稀

8、释成终浓度2050ng/l,保存-20备用。2.2ISSR-PR反响初始条件及步伐参照文献中文蛤9、河蟹10等ISSR阐发的反响体系和扩增步伐举行预实行，方案初始50l反响体系：1Taq酶配套缓冲液，DNA模板50ng，2.5UTaqDNA聚合酶，2lLgl2，0.8lL引物，0.2lLdNTPs。扩增步伐为：94预变性5in；然后是94变性30s，50复性30s，72延伸1.5in，共35个循环；72延伸5in，反响竣事后，4保存。PR扩增产物在1.5(V)的琼脂糖凝胶中电泳分散，电压5V。电泳竣事后，在UVP凝胶成像体系上不雅察并照相记载。2.3反响体系的优化在50l反响体系中，模板DNA

9、(2050ng/l)别离为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0l；引物浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2l/L；dNTPs的浓度别离为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6l/L。Taq酶和g2+接纳双因素作用观察见表1。每一个符合条件确定后，作为后续研究的一个条件。表1g2+浓度和Taq酶双因素观察略2.4退火温度简直定接纳梯度PR形式，设定退火温度最低47.0和最高56.0，扩增仪主动天生l2个温度梯度，选择此中6个：49.8，50.9，52，53.1，54.2，56。3结果3.1模板DNA浓度简直定相宜的模板量是包管特异性扩增的条件。模板量过多会低落特异性扩增

10、服从，增长非特异性产物。研究表白，DNA模板量在10200ng，扩增程度及扩增条带无显着差异，以其他地龙DNA为模板也得到同样的结果见图1。因此，将地龙扩增体系中的模板参加量定为50100ng，即在50l反响体系中，参加模板DNA2l2050ng/l)。3.2引物浓度选择引物浓度干系到扩增产物的质量，浓度太低不克不及举行有用地扩增，浓度太高会增长引物二聚体地形成，导致条带不不变及清楚度落落。结果表白，随着引物浓度的升高，扩增带由弱到强。引物浓度在0.2，0.4，0.6lL-1时较弱，0.8，1.0lL-1时扩增的条带数和亮度均同等，当到达1.2lL-1时非特异性扩增加强见图1。按照实行结果选择

11、0.8lL-1，即在50l反响体系中，参加ISSR引物20lL-12l。3.3dNTPs浓度选择底物dNTPs浓度过高，会导致聚合酶错误的掺入，浓度过低，又会影响合成服从，乃至会因dNTPs过早斲丧而使产物单链化，影响扩增结果。通常在PR反响体系中，dNTPs浓度应在0.020.2lL-111，试验结果表白：dNTPs浓度在0.10.25lL-1时，均有扩增产物。浓度在0.2lL-1时，PR反响不变性和扩增产物服从最高，配景滋扰少，条带清楚见图1。因此，将地龙ISSR-PR扩增体系中的dNTPs浓度定为0.2lL-1，即在50l反响体系中，参加dNTPs10lL-1eah1l。3.4Taq酶和

12、g2+双因素作用观察Taq酶的种类以及利用量直接影响扩增反响的乐成与否。利用高浓度的Taq酶不但进步了本钱，并且也轻易产生非特异性扩增产物；而当Taq酶浓度过低时，那么会使酶过早地斲丧完，产物合成服从低。g2+浓度是影响PR结果的紧张变量之一。选择符合的g2+浓度对PR反响至关紧张。Taq酶是g2+依靠酶，对g2+浓度非常敏感。引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响，特殊是此中的g2+浓度能影响反响的特异性和扩增片断的产率。在一样平常的PR体系中，g2+用量比力符合的是1.52.0lL-111，50l体系中Taq酶用量为1.05.0U11。研究结果表白：在50lPR体系中，2

13、.0lL-1的g2+结合2.0UTaq酶用量反响结果最正确。见图2。3.5引物退火温度的观察PR反响中，退火温度的凹凸直接影响到引物与模板DNA的特异性结合。用以上所得到的最正确因素程度组合，针对引物的T值举行梯度退火实行，PR产物举行电泳检测，以扩增出条带多，配景清楚的温度作为候选的火候温度。结果见图3。表白52为引物834较符合退火温度。通过对上述条件的优化，挑选出相宜于地龙药材ISSRPR的反响体系，50ul的体系构成为：1Taq酶配套缓冲液，DNA模板约50ng，2.5UTaqDNA聚合酶，2lLgl2，0.8lL引物，0.2lLdNTPs。扩增步伐为：94预变性5in；94变性30s

14、，50复性30s据差异引物的退火温度，72延伸1.5in，共35个循环；72延伸5in，反响竣事后，4保存。利用此优化体系，选择引物UB834对地龙药材的18个样品举行了扩增，得到了配景清楚、多态性不变富厚的DNA扩增片断见图4，可用于地龙药材的区分及遗传布局阐发研究。4讨论ISSR扩增易受多种因素的影响，如模板DNA、Taq酶、dNTPs、g2+以及引物等，扩增条件的变革会对ISSR图谱产生较大的影响，从而影响ISSR阐发的正确性和不变性，因此为了得到重复性和可靠性高的ISSR图谱，对地龙举行引物的筛癣PR扩增条件的优化及差异引物的退火温度简直定非常需要。引物选择是ISSR技能中最关键和紧张

15、的一环。常为3或5端加锚14个碱基的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数常为48次。现实研究事情中常参考加拿年老伦比亚大学UniversityfBritishlubia，UB方案并宣布的ISSR引物序列。本实行接纳逐一研究各因素差异处置惩罚程度的影响，较快地创立了得当地龙的ISSRPR优化体系，为后续地龙药材的区分及遗传布局阐发研究奠基了技能和理论基矗【参考文献】1吴文如,李薇.地龙类药用动物的比力区分J.当代生物医学希望,2022,7(11):1754.2国度药典委员会.中国药典，部S.北京：化学产业出书社,2022：80.3李兰燕,王树春,吴云山,等广地龙的X射线衍射Furier

16、谱断定J.中成药,2002,24(5):380.4姜文红,张清波.地龙HPL指纹图谱阐发要领的研究J.中医药学报，2022,34(6):13.5ZietkieizE,RafalskiA,LabudaDGenefingerprintingbysiplesequenerepeats(SSR)anhrdplyerasehainreatinaplifiatinJ.Genis,1994,20:176.6LiHShenGZGenetidiversityfsnneratiaalbainhinadetetedbyintersiplesequenerepeats(ISSR)analysisJ.AtaBtSin,2022,46(5):137.7AirajuJSDhlakiaBB,SantraDK,eta1Identifiatinfintersiplesequenerepeat(ISSR)arkersassiatedithseedsizeinheatJ.Ther