基因工程 外文翻译

1、由共表达碳酰还原酶和葡萄糖脱氢酶的大 肠杆菌转化细胞合成纯光学(S) -4-氯-3-羟 基丁酸乙酯1摘要本本篇文献研究了利用COBE不对称合成(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)。大肠 杆菌细胞作为催化剂同时表达了来自念珠菌属辛夷的碳酰还原酶和来自巨大芽抱杆菌的葡 萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，(S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到2.58M (430g/l),摩尔产率达到85%。大肠杆菌的副产物S1和GDH也达到了 1.25M (208g/l), COBE在水相中不稳定，所以(S)-CHBE可以在水单相中不停的生成。在这种情况下，适当 的从NADP+到CHBE的转变达

2、到了 21,600 mol/mol。所形成的CHBE的旋光度在这种体 系中100%对映体过量。在水相中用携带含有S1和GDH基因质粒的E. coli HB101作为催 化剂不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业GDH或者有机溶剂。因 此，这种体系对于实际合成纯光学活性的(S)-CHBE是非常方便的。介绍具有旋光性的(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯在药物制剂的合成中是重要的手性化合物。其 右旋体是L-卡尼汀的前体，其左旋体是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的起始材料。许 多研究描述了以面包酵母为基础微生物或者酶的COBE的不对称还原。我们先前已经知道 利用来自念珠菌属辛夷AKU4

3、643细胞催化COBE生成光学纯度96%的CHBE。这种酵母 至少有三种立体选择性的还原酶，这种酵母产生的CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中， NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并测序编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠 杆菌转化细胞在葡萄糖，NADP+和商业化的葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子催化 COBE生成纯光学的CHBE。我们构建这三种大肠杆菌转化细胞共表达来自的S1和来自巨大芽抱杆菌的GDH，并分 析COBE被这几种菌株催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用酶催化还原COBE生 成CHBE光学纯度可达92%，也提到了因为底物(COBE)在水相中不稳定，并且酶容易钝 化，所

4、以利用酶或者微生物在有机溶剂/水两相体系中催化反应。我们研究了在水单相体系中由COBE还原生成纯光学的CHBE,还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。2材料和方法2.1菌株和质粒本次实验中使用的大肠杆菌是JM109 and HB101。来自B. megaterium的GDH基因插入 到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由到由大阪大学的urabe教授提 供。质粒pSL301和pTrc99A是由美国的Invitrogen公司和英国的公司分别购买的。质粒 pUC19和pST28是由日本takara公司购买的。这次实验使用的重组质粒构建如下：质粒pGDA2被EcoRI和

5、PstI双酶切从而分离出 一个大小约为0.9kb的包含有GDH基因的DNA片段。这个片段被插入到质粒构建pNTS1 是为了过表达前文所提到的S1,这个0.9kb大小的片段被插入到pNTS1的 EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1GPsl301的EcoRI-PstI酶切位点从而构建出质粒pSLG。 质粒pSLG被EcoRI和XhoI构建pNTS1是为了过表达前文所提到的S1，这个0.9kb大小的 片段被插入到pNTS1的EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1， 首先需要构建pNTGo两个合成引物(引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTA

6、和引物2, TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT和作为模板的pGDA2是PCR反应需要的。PCR得到 的片段是由NdeI和EcoRI双酶切和并插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI酶切位点来得到 pNTGo根据报道，pUCNT是由pUC19和pTrc99A构建而来。为了构建质粒pNTGS1，两 个合成引物(引物 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAAGGCTAAGAACTTCTCCAACG and 引物 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)包括了 S1 基因作为模 板oPcr产物片段被EcoRI和SalI双酶切然后被插入到p

7、ntg的EcoRI-SalI酶切位点得到pntg1. 质粒pNTS1G, pNTGS1或者pNTG都是导入大肠杆菌HB101.质粒pGDA2被EcoRI和PstI 双酶切得到包含GDH基因的0.9kb大小的DNA片段。为了构建pSTVG质粒，这个片段被 插入到pSTV28质粒的EcoRI-PstI的酶切位点。pSTVG质粒被导入到E. coli HB101。2.2培养基和培菌2*YT培养基 包含有1.6%细菌用胰蛋白胨，1.0%酵母提取物，0.5% NaCl，pH7.0.携带有pNTS1,pNTG pNTS1G或pNTGS1的大肠杆菌HB101被接种到有0.1mg/ml氨苄青 霉素的2ml的2

8、*YT培养基，37C摇床15小时。将0.5ml菌液接种到100ml2*YT培养基的 500ml烧瓶中。在37C摇床培养13小时。携带有pNTSl和pSTVG质粒的大肠杆菌HB101 在2*YT培养基中培养方法相似,只是培养基中要加入0.1 mg/ml的氨苄青霉素和0.1 mg/ml 的氯霉素。2.3无细胞抽提液和酶鉴定将100ml培养液离心收获菌体，用50ml0.1mol/LpH为6.5的磷酸缓冲液悬浮，然后超 声粉碎。细胞碎片通过离心可以去除，收集上层清液就是无细胞抽提物。碳酰还原酶S1的 活性由分光光度计测量如下：测定的混合物包括：0.1mol/LpH6.5的磷酸二氢钾缓冲液， 0.1mM

9、NADPH和1 mMCOBE。反应在30C条件下反应，并且随时监测其在340nm处的吸 光值。测GDH混合物包括：1MpH8.0的Tris-HCl的缓冲液，100mM的葡萄糖，2mM的 NADP+。反应在25C下进行，监测其在340nm处的吸光值。一个单位S1或GDH被定义 为每分钟催化还原lymol NADP+或氧化1 ymol NADPH的量。蛋白质的测定通过含有考马 斯亮蓝的蛋白质测定试剂利用牛血清白蛋白作为标准进行测定。2.4酶稳定性的研究一毫升含有含有pNTS1质粒的E. coli HB101的无细胞抽提液的100mM磷酸氢二钾缓 冲液（pH6.5）与等体积的有机溶剂混合。混合物在3

10、0 C震摇48小时后，水相中残留的酶 活力即是上述的酶活力。2.5表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应混合物包含有带有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的菌液15ml，pNTS1质粒的大肠杆菌 HB101 的菌液 17ml， 1.6 mg NADP+，4 g 葡萄糖，2.5g 的 COBE，25ml 的 n-butyl acetate 丁 酰醋酸盐和大约25mg的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。用5M的NaOH溶液将pH控制 在6.5。在反应两小时后，加入1.25gCOBE和2.5g葡萄糖到该混合物中。比较大肠杆菌转 化细胞共表达GDH和S1基因，携带有p

11、NTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml菌液取代了携 带有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101菌液。其他的成分和步骤和上述的方法相似。2.6 COBE在两相系统中还原生成（S） -CHBE反应混合物包含50ml E. coli HB101转化细胞的培养液，3.2mgNADP+,11g 葡萄糖，lOgCOBE, 50ml 丁酰醋酸，和大概50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100.在30C温度下将其混合均匀，并用5M的NaOH溶液将pH控制在6.5。在第3小时加入 5gCOBE和5.5g葡萄糖或者在第7小时加入10gCOBE和11g葡萄糖，分别在第26小时加 入 3.2gNAD

12、P+。2.7 COBE在水相中还原成（S）-CHBE的反应反应的体系是由50ml大肠杆菌HB101转化细胞的菌液，3.1mgNADP+，11g葡萄糖和 大约50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应混合物在30C15mg的COBE通过微量 添加机器以0.02 g/min的速率连续12小时恒定的加入到体系中。用5M的NaOH溶液将pH 控制在6.5。反应混合物用100ml乙酸乙酯萃取。有机层用无水硫酸钠吸干，并在真空中脱 水。3分析离心反应混合物得到的有机层通过气相色谱法测定其CHBE和COBEoCOBE的光学纯 度如前所述通过高效液相色谱法进行分析。31酶和化学试剂限制性内切酶和

13、DNA聚合酶由takara公司购得，COBE （分子量：164.59）由东京Tokyo Kasei Kogyo公司购得，消旋体CHBE （分子量166.6）通过COBE及NaBH4合成。所有其 他化学试剂都是分析等级和商业化的试剂。Table 1 SI and GDH activities in cell-free extracts of E eoli transfonnantsPlasmid transformedSpecific activity (U/mg)SIGDHpUCNT0.010.01pNTSl16.00.01pNTG0.01121pNTSl G1L577.2pNTGSl4.90

14、117pNTSl and pSTVG13.5L60Table 2 Stability of S1 in various organic solvents. For other conditions, see the textOrganic solventRelative remaining activity (%)None77 JEthvl acetate7 7“Butyl acetate31Jl-Octanol56.0Chlomforin0Dichlorotnethane0Isopropyl ether34.8Toluene04结果4.1对产生S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建为了在同一大

15、肠杆菌细胞中表达碳酰还原酶S1和GDH基因，要构建四个表达型载体。 质粒pNTSIG和pNTGSl包含有来自C. magnoliae的S1基因，来自B. megaterium的GDH 基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子，质粒pNTS1包含有S1基因， 来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子。在大肠杆菌转化细胞的无细胞抽提 物的酶活力如表一所示。携带有运输质粒pUCNT的大肠杆菌细胞无法检测到其S1和GDH 活性。携带有pNTS1G或pNTGS1质粒在没有IPTG的诱导下有S1和GDH的活性。在这 两个转化菌种中，S1的活力小于GDH的活力。为了

16、得到S1活性等于或者大于GDH的大 肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝的载体PSTV28，来表达GDH基因。它可能可以通过降 低GDH的活性从而提高S1的活性。质粒pSTVG包含有GDH基因，lac启动子，和氯霉素 抗性基因，以及与pNTS1具有相容性的从pACYC184得来的复制起始位点。在携带有pNTS1 和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性要高于GDH的活性，但是GDH的活性可能 会太低而在COBE还原反应中不能再生。5讨论共表达的S1和GDH的基因在大肠杆菌HB101，将这些基因串联到从pUC19和pTrc99A （Nanba等，1999）衍生的质粒载体pUCNT，并且在无IPTG

17、诱导下实现。因为GDH的活 性明显高于S1的活性，在这两个转化体越高，转化大肠杆菌HB101转化，其中S1活性高 于GDH活性该转化携带两个向量，PS1和PS TVG，将其从一种低拷贝载体构建，PSTV28（本间等人1995; Takahashi等人，1995）。将得到的转化体的GDH活性非常低，但它的S1 活性比其他两个转化体的高。该菌株产生的（S）-CHBE比其它两个品系确实较低浓度，它 的LDH活性可能太低，以再生的NADPH。以前报告中的有机溶剂-水两相系统中描述的酶和微生物神户还原（Bare等人1991; Kataoka等人，1999; Shimizu等人，1990）。两相体系反应的

18、优点是：（1）在水相中不稳定 COBE被萃取稳定化成为有机相；（2）烯ZYME灭活COBE和CHBE被提取的酶溶液，这 些化合物的最小化。COBE减少由羰基还原酶需要辅酶的再生系统，如葡萄糖,NADP +和 GDH。这是很容 易再生的NADPH由附加荷兰国际集团市售的GDH到反应混合物中，但是这是非常昂贵的 工业手性合成子的合成方法。我们发现，COBE减少是可能的混合大肠杆菌高产S1和大肠 杆菌高产GDH的培养液。此方法可能适用于其它还原反应通过使用其他羰基还原酶，代替 S1中，虽然COBE红眼，灰由大肠杆菌转化联产S1和GDH的是这涉及相同的酶activi-关 系是有利的。基底和科恩-ZYME的S1和GDH之间的传递可以是在此case.The培养转化大 肠杆菌HB101的肉汤携带pNTS