常用消毒方法对HBVDNA灭活效果的评价

1、常用消毒方法对HBV DNA灭活效果的评价王家银（临沂市人民医院，山东临沂 276003）摘要：目的 探讨清除实验室HBV DNA污染的最有效方法。方法 采用FQ-PCR技术对经紫外线照射或加入84消毒液处理后的HBV DNA阳性血清标本，检测其HBV DNA含量变化。结果 紫外线消毒12小时以上血清标本HBV DNA含量下降，并随照射时间的延长，其含量呈逐渐减少趋势；常用浓度（1：50）的84消毒剂可使HBV-DNA含量明显降低，高浓度（1：4）的84消毒剂或原液消毒血清标本后检测不到HBV-DNA。讨论 紫外线照射消毒法不能完全清除血清标本HBV DNA；高浓度84消毒剂是清除实验室HBV

2、 DNA污染的最有效的消毒方法。关键词：病毒；乙型肝炎；DNA；消毒；聚合酶链反应血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）的检测常用于间接评价消毒剂杀灭病毒的效果。控制外源性DNA污染目前检测HBV DNA较多都采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术1,2，这种技术操作简单，不易引起污染。FQ-PCR检测HBV DNA准确度和重复性除扩增原因外，血清核酸提取也是重要影响因素3。我们应用沉淀煮沸提取法，比较了不同煮沸时间及不同浓度肝素抗凝剂对HBV DNA荧光定量检测结果的影响，现报告如下。1 材料与方法1.1 标本 取16例HBV DNA测定为107拷贝/毫升的慢性乙型肝炎患者血清，外观无

3、黄疸、脂血、溶血，混合后备用。1.2 试剂 HBV DNA荧光定量PCR试剂盒，由深圳匹基生物工程股份有限公司提供。肝素由江苏万邦生化医药股份有限公司提供。1.3 仪器 PE-5700型荧光定量基因扩增仪（美国），恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）。1.4 核酸提取 1.4.1 常规沉淀煮沸裂解法提取核酸：取血清100L加试剂盒中提取液100L混匀，13000r/min离心10分钟，弃上清，加入25L提取液，混匀，置恒温金属浴100 10分钟，13000r/min离心10分钟，取上清液2L扩增。再取4份血清重复以上步骤4次，共得5份模板行PCR扩增。1.4.2 不同加热时间提取核酸：取5份10

4、0L的血清分别加100L提取液，混匀，13000r/min离心10分钟，弃上清，加入25L提取液，混匀，置恒温金属浴温度达100后2min、4min、6min、8min、12min各取出1份标本，13000r/min离心10分钟，取上清液2L扩增。重复以上步骤4次，每个时间段共得5份模板行PCR扩增。1.4.3 不同浓度肝素标本：取3份1mL的血清分别加入6.25U、62.5U、625U肝素，分别提取核酸（提取方法同1.4.1）行PCR扩增。1.5 FQ-PCR扩增 PCR反应混合液38L加入模板2L，混匀，置PE-5700扩增仪中。反应条件37 2min，94 1min后95 5sec，55

5、 30sec共40循环。反应结束后，根据同时扩增的标准品自动读取拷贝数。1.6 统计学处理方法 以HBV DNA含量以测定拷贝数的对数值进行统计学处理，采用方差分析进行统计学处理。2 结果2.1 常规沉淀煮沸裂解法提取核酸后5份模板HBV DNA测定均值为2.94107拷贝/毫升。2.2 加热不同时间提取核酸后HBV DNA测定值见表1。与常规沉淀煮沸裂解法提取核酸后HBV DNA测定均值相比，无明显差异（P0.05）。表1.不同加热时间提取核酸后HBV DNA测定值（单位：拷贝/毫升）加热时间2min4min6min8min12minHBV-DNA2.031071.221072.101073

6、.511074.221072.3 加入不同浓度肝素的血清标本提取核酸后HBV DNA测定值见表2。不同浓度肝素的血清标本提取核酸后HBV DNA测定值无明显差异（P0.05）。与常规沉淀煮沸裂解法提取核酸后HBV DNA测定均值相比，亦无明显差异（P0.05）。表2. 含有不同浓度肝素的血清标本HBV DNA测定值（单位：拷贝/毫升）肝素浓度6.25U62.5U625UHBV-DNA3.021072.281071.091073 讨论乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）是反映乙型肝炎病毒在体内复制最直接、可靠的实验指标。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术因其快速、灵敏、特异性强、PCR产

7、物封闭不易引起污染等优点而成为临床动态观察HBV感染及抗病毒治疗疗效判断的重要参考指标2。PCR技术历经二十年的发展和完善，由最初的定性实验到目前广泛应用的实时荧光定量PCR，作为一种特异、敏感的检测方法，FQ-PCR对实验的各个环节要求甚高。随着仪器的不断改进及商品化试剂盒的研发，影响PCR扩增阶段的技术已非常成熟，其检测结果更为稳定，这在实际应用中已得到实验人员的共识4。目前对FQ-PCR检测方法的探讨更集中在标本处理及核酸提取等扩增前步骤中，如果标本中存在有干扰因子或采用不同的核酸提取方法都有可能造成HBV DNA扩增模板的差异而影响最终的检测结果。我们采用较为常用的沉淀煮沸裂解法处理血

8、清标本，对比不同煮沸时间对HBV DNA扩增结果的影响，结果显示血清标本提取DNA后煮沸从2分钟到12分钟，HBV DNA检测结果无明显差异。目前普遍认为标本中含有肝素抗凝剂对PCR检测结果影响较大，而本次实验结果显示标本中加入6.25625U浓度的肝素所得HBV DNA检测结果与不含肝素的标本相比无明显差异，可能的原因是沉淀煮沸裂解法第一步高速离心沉淀HBV病毒颗粒时，弃去上清，同时去除了大部分的肝素，使肝素的影响减少。从本次实验结果可以看出，沉淀煮沸裂解法操作简便，重复实验结果一致性好，且加热时间长短及肝素抗凝剂等因素对其提取HBV DNA模板影响较小，是一种较稳定、可靠的HBV DNA提取方法。参考文献：1 Heemann KH,Cerlich WH,Chudy M,et al.Quantitative detection of hepatitis B virus DNA in two international reference plasma preparations.Eurohep Pathobiology Group. J-Clirr Microbiol, 1999, 37: 68-73.2 程钢，何蕴韶，周新宇.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒.中华医学检验杂志，1999，22：135-1