大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改良方法研究

1、大鼠单根近球肾小管钠泵活性测定的改进要领研究【关键词】近球小管;钠泵;活性测定;改进要领;大鼠肾小管基底膜上的钠泵，是肾脏实现其成效作用的关键酶，测定该酶的活性，对差异状态下肾脏的成效研究具有紧张的意义。测定单根肾小管钠泵活性的要领，duet起首于1979年举行了较为详细的报道1简称duet法，该要领如今还是测定肾小管钠泵活性的最正确最常用的要领，特殊是测定差异节段肾小管的钠泵活性2。已往的二十多年，duet法得到了一些革新3,4，但是革新并不明显。duet法的技能要求高，预备与操纵历程都比力庞大耗时，与32p打仗时间较长，而该物质放射性相对较强，海内大多数实行室都未便开展，造成此项研究事情在

2、海内的几近空缺。改进duet法简称改进法，即在不影响测定结果的环境下，简化操纵条件及步调，低落物耗和时耗，使它有用于海内一样平常实行室，就显得非常需要和急迫。1质料1.1实行动物雄性istar大鼠，体重200g，购自南边医大学动物实行中心。2实行要领拔取10只大鼠，均匀分为2组，别离用于duet法和改进法测定小管的钠泵活性，改进法实行要领如下：2.1单根肾近球小管的分散实行大鼠用1%戊巴比妥钠40gkg-1，ip麻醉后，右侧位结实于鼠板上。再沿脊柱左侧剪开皮肤，表露肾脏，分散腹自动脉，结扎除左肾动脉以外的分支，经腹自动脉插管灌注左肾，先用1l1%肝素钠溶液，接着用1l04含0.2%胶原酶的分散

3、液灌注。灌注后敏捷切下左肾，撤除肾包膜和肾蒂布局，置于清洁玻片上玻片下安排低温冰袋。用剃须刀片，将肾皮质沿皮质髓质轴切成0.51.0厚的薄片。将约莫10片肾构造放入一容积为2l的离心管中，管内预先装有1l含0.15%胶原酶的分散液并预热至37，恒温水浴槽中孵育1520in，连续充入95%的2和5%2的混淆气体。孵育完毕用2l含0.05%牛血明净卵白的分散液漂洗34次，04保存并于30in内完身分散。汲取0.1l含肾小管构造的分散液到细菌学载玻片的中心凹处，在体视镜载物台上安排一个直径为90造就皿，内装清洁冰水和碎冰块，在造就皿内安排一个符合铝架，载玻片平放在铝架上，使玻片底部恰好与冰水打仗提供

4、04的分散环境，用微分散针分散小管。识别近球小管是按照它与肾小球、肾小囊、入球小动脉和别的肾小管节段的剖解干系和形态学特点决定的。转移前的小管直接摄像并保存图片，按照放大倍率确定小管长度。3结果3.1微分散小管的结果图片见图1，a表现转移后的单根肾近球小管节段；b表现微分散的近球小管电镜图象。电镜下可见近球小管管腔面摆列有长而麋集的微绒毛箭头所示，它是近球小管奇特的超微布局。其次可见侧突兴隆，质膜内褶较深，可达细胞的游离面，胞吞小泡多，溶酶体兴隆，长杆线粒体非常富厚，与质膜内褶平行摆列。3.2两种要领钠泵活性测定结果与部门操纵耗时比力结果见表1，运用改进法测定钠泵活性结果无明显差异，但对小管长

5、度确定均匀耗时和转移含32p的孵育液均匀耗时显着低落。表1两种要领测定结果与部门操纵耗时比力注：*与duet法比p0.054讨论测定肾小管钠泵的活性，duet法还是如今最常用的要领。本实行技能是在duet法的底子上，举行了较大的革新和美满，使实行条件和实行自己变得相对简朴易行，可操纵性大为进步，并且对测定结果并无显着影响。本实行要领的革新重要表如今以下十个方面：结实要领：与以往仰位结实比力，右侧卧位结实，沿脊柱左侧手术，左肾动脉及腹自动脉表露充实，手术历程快，对别的脏器的影响校灌注：选择从腹自动脉途径插管灌注，比直接在左肾动脉插管要宁静快捷；先利用抗凝剂肝素冲洗，可以或许扫除肾脏内血液身分，淘

6、汰胶原酶的用量以及便利反面的漂洗和分散。灌注液和灌注速率：利用高浓度低用量的灌注液，低落灌注速率0.5lin-1，可以进步胶原酶的利用率，收缩孵育时间，进步孵育结果。通气装置：本实行用一浅易装置完成，即在医用氧气袋的橡皮管上毗连一个三通管，在此中一个通道上接上一根聚乙烯小管，即可便利操纵通气。微分散针：分散针是利用玻璃毛细吸管，在酒精喷灯上拉制而成，由于这种要领制备的微分针前端带有小弯钩，比用玻璃微电极拉制器拉制的微分针越发便利有用。分散环境：环境温度稍高，载玻片上小管四周液体稳态环境极易改变，严峻影响小管生物活性，但是，在一样平常实行室，提供一个04的事情环境是比力困难或造价昂扬。本实行方案

7、了一个浅易的低温操纵环境，结果好，险些无需本钱。小管长度简直定：将小管转移到另一载玻片上，利用倒置显微镜照相，确定小管长度，然后再将小管转移到产生酶促反响的铝片上。如许操纵难度大，小管表露时间长，酶的活性轻易受到影响。假设在体视镜上装上显像体系，就可以在小管分散后，转移前举行直接照相。如许，既简化了操纵步调，又能最大程度包管小管及酶的活性。冻融质料：以往利用的干冰，在许多地方不易购置，保存时间又短。用存放在-80的超低温冰袋取代干冰，本钱极低，操纵便利。酶促反响载体：将以往的带凹结实铝槽，换成超薄锡薄纸片，紧贴在金属盘内，反响停顿后，直接将锡薄纸片转移到活性碳悬液中，快速便利，制止以往重复洗濯铝槽造成的无机磷丧失，进步实行结果的正确性。由于32p的放射性较强，反响载体的改变可以大幅收缩操纵者与辐射物打仗的时间。密封金属盘：在小管钠泵活性测定的各个环节中，包管小管环境的相对密闭性，防范反响液蒸发或与水雾