质粒大抽步骤

1、4/4质粒大抽（手提）步骤资料来自网络,适当改进试剂配制:ffr QBT（000ml）：分别称取al4。83g，MO 1。4g,加入600ml 双蒸水,用NaH调节pH值为7。,然后加入1ml 异丙醇,定容至1000ml.Bfer QC(1000ml）：分别称取N 5。44，MS 10.46,加入600 双蒸水，用NaOH调节H值为7。0,然后加入0m异丙醇,定容至100ml.Buffr F(1000l):称取Nl 7.05，量取M Ts-H 25ml,加入8ml 双蒸水，用NO调节p值为85，然后加入50m异丙醇，定容至100。1M NaOH (40l ）:分子量：0，秤取16g NaOH，

2、溶于40l 双蒸水中。2Mi-HCl (00）：分子量为1211，秤取121.1g Tris，溶于40 ml双蒸水中，用HCl调节值为.0,定容至0。10TBfer：量取MTri-HC（p8.）100，50mM EDTA（8.0) 20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。Bffe 1 （000ml）：用0ml离心管量取20ml 0.5M的TA，然后量取25ml2的TrisHC，加入70 双蒸水，用HC调节pH值为8.0,定容至1000。 ffer P2(000ml）：称取0g SDS，放入100m的玻璃瓶中,然后加入750ml 双蒸水,最后加入00 ml M的NaOH，混匀，室温

3、放置过夜，使其自溶.(注：不需要定容，严格按步骤操作)Buffer P3(1000ml）：秤取294。g乙酸钾,溶于0m 双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为55,定容至000l。配制RNse：（1） 将RNae粉末溶于10的乙酸钾（即Bffr P3）,配制成浓度为10mg/ml的溶液。（2)将配好的ase溶液100加热10min, 随后冷却至室温.（） 用1M 的TrsHl调节pH值至7.，大约需要0。1体积的Tsl。（) 分装RNase溶液于1.ml管中，-2保存。使用前注意事项:在提lo-cpy(低拷贝)质粒时，增加ysisbufr（裂解液)体积可以提高碱性裂解的效率以及DN的产量。uffer

4、 P1在使用前加RNe A slution（RA酶溶液)，一瓶Buer P加入一小瓶Nae A（用前瞬时离心），终浓度为10u/ml。检测Bfr 2是否有因低温储存而引起的SD沉淀。如有必要,将DS在37溶解。Buer P3在下预冷。在选择平板上挑选一个单克隆,在含有相应抗性的5ml中液体B培养基初培养：摇床00-00pm下培养约8h。 （使用的管子或烧瓶至少是培养体积的4倍）将初培养菌液用选择性L培养基稀释到1500到100。ihp plasmid（高拷贝质粒)：用10000ul初培养液接种00ml介质。Lowcoyplasmid(低拷贝质粒）:用250-5l初培养液接种00ml。37摇床3

5、00rpm下初培养约11。OD60=5，此时培养细胞浓度可达到约34个/ml。 (使用的烧瓶或容器至少是培养体积的4倍,最好使用锥形瓶摇菌)、离心机000g离心min收集细菌细胞。（如果想在此步骤停止以后再做，把细胞-20冻存）10Bufer P重悬细菌细胞。（确保Bufer P里已经加入Rse A)（为使细菌完全重悬，用振荡器充分溶解菌液沉淀）加入10mufer,轻轻上下颠倒封盖的管子6次彻底混合溶液，室温(15-5)下放置5min.(不要涡旋，因为涡旋能导致基因组DN机械断裂。裂解液会有粘性.溶解反应不要超过mi。装有Buffer 的瓶子用后要立即盖紧，以免被空气中的C2酸化).加0l预冷

6、的uffe P3，立即轻轻上下颠倒4次混匀,冰上放置20in。 （预冷的Bufer P3和冰上放置能促进沉淀。加入uer P3后有乳白色的物质形成且裂解液粘性减少.沉淀物中含有基因组NA、蛋白质、细胞残渣) 。20 mn后，600 g 4离心25mn。同时,向柱子中加入ml uffr QB，使其全部流过柱子,平衡柱子。剪一小块纱布,折叠4层,放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中,最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中,使其充分流过柱子.（如果此步不只1个质粒时,挤压不同质粒的纱布时,一定要换手套，避免污染质粒）。用30mBufeQ （wsh fer)洗柱子。 （BfferQC通过重

7、力流通过柱子。第一次清洗就足够去除大部分质粒NA沉淀中的污染物。但是，当培养体积较大或者菌种会产生大量的糖类时第二次清洗是必要的）10、洗脱质粒：向柱子中加15Bufr QF，靠重力作用使其全部通过柱子,收集洗脱液。(注：要收集到一个新的管中。)11、沉淀质粒:向收集的液体中,加入0。倍体积（即10.5 m)异丙醇,轻轻混匀,0 离心25 mi。（异丙醇可以充分沉淀质粒,但同时会沉淀很多盐分）12、清洗质粒:离心后，注意质粒贴壁的方向，应从其侧面倒掉废液。用ml70室温保存的乙醇洗涤颗粒，将含有DNA的乙醇转移到5ml的P管中, 6000 g4离心10,轻轻吸弃废液。（残留的乙醇会影响后续反应中的酶活性)。将EP管倒扣于吸水纸上,空气干燥5-10min，用适当体积的TE溶解DN.柱子回收: (1）先用自来水冲洗柱子内外；再用蒸馏水和双蒸水冲洗柱子内外。 (2）2ml1M Hl流过柱子一遍，流完后再加1ml的1 M HCl，使其部分流出，最后剩余78m