RNA值RIN-RNA质量控制标准化

1、RNA完满值(RIN)RNA质量控制标准化应用OdiloMuellerSamarLightfootAndreasSchroeder大纲评估RNA完满性是获得有意义基因表达数据的第一个要点步骤。采用完整RNA是成功微阵列或qRT-PCR解析的要点要素。Agilent2100生物解析仪系统和RNA试剂盒在协助研究者确定RNA质量方面发挥重要作用。Agilent2100生物解析仪系统上生成的谱图包括浓度信息，赞同直观检查RNA完满性，并生成核糖体比率。本应用简报描述的新软件算法开发用于从生物解析仪电泳图提取RNA样品完满性的信息。Note:Trapsetfor16%ofsize.前言确定RNA初步资

2、料的完满性是基因表达解析中的一个要点步骤。Agilent2100生物解析仪系统及相关的RNA6000Nano试剂盒和Pico试剂盒已成为RNA质量评估和定量的1,2标准。在精美加工的芯片上利用电泳分别，分别RNA样品，并随后经过激光引诱荧光检测法检测。生物解析仪软件生成电泳图和凝胶样图像，并显现多种结果，如样品浓度和核糖体比率。电泳图供应了RNA样质量量的详细直观评估结果。可是，依赖人工目视讲解数据的方法拥有内在弊端。此前，研究者们已经将核糖体比率在平板凝胶解析中并作为特色在生物解析仪软件中用来表征RNA完满性的状态。采用核糖体比率的总RNA样品平板凝胶解析平时获得不正确的RNA完满性3评估结

3、果。经过显示RNA片段大小分布的详细画面，Agilent2100生物解析仪系统供应更好的RNA完满性评估结果。RNA降解是一个逐渐的过程。随着降解推进（图1），18S/28S核糖体条带比减小，而两个核糖体峰和下位内标之间的基线信号增大。生物解析仪软件自动生成18S/28S核糖体亚基的比率。尽管核糖体比率在确定凝胶电泳中样品降解程度方面发挥重要作用，但Agilent2100生物解析仪系统中更详细的解析表示，该比率未充分描述样品完满性。为了将RNA完满性讲解过程标准化，安捷伦科技有限公司已经推出一种新的RNA质量评估工具。开发RNA完满值(RIN)旨在除掉RNA质量控制中的个人讲解。它将完满电泳图

4、纳入考量。基于1至10的编号系统，RIN软件算法可将真核生物总RNA分类，其中1代表降解最严重的状况并且10代表最完满。经过这种方式，有助于讲解电泳图，令样品比较成为可能，并保证明验的重复性。RIN工具的开发RIN软件算法针对Agilent2100生物解析仪系统中用真核生物总RNANano解析法采集的样品开发。输入数据包括来自三个哺乳动物物种（人类、小鼠和大鼠）的不相同组织图1总RNA样品经过不相同时间降解，并且在Agilent2100生物解析仪系统上使用真核细胞总RNANano解析法解析所得的样品。随着降解推进，能够观察到向较短片段大小方向偏移2中约1300份总RNA样品，所有样品的完满程度

5、各不相同。RNA样品的分类由应用专家手动进行，他们将每份总RNA样品分类至1-10的预定编号系统。图2显现了不相同RIN类其他代表性电泳图（编号分别为6910、6、3、2）。为开发RIN算法，采用了神经网络等自适应学习工具（工具由QuantiomBioinformatics供应）。这些工具赞同确定能够从电泳图提取的要点特色。这些特色是能够采用合适积分仪解析的电泳图组成部分。它们能够是信号面积、强度、比值等。图3中列出电泳图的重要要素。它们包括不相同的地区（前区、5S区、快速区、中区、前体区、后区）和峰（标准品、18S、28S）。RIN可视化先前版本生物分级软件中存在的数69图2用于调试RNA完

6、满值(RIN)软件的样品电泳图。样品为完满样品(RIN10)至降解样品(RIN2)据能够相同存在于下一版Expert软件中，比方RNA面积、RNA浓度和rRNA比率。RIN软件包括RIN值（图4），该值能够表述为小数或整数。RIN值能够在“全局高级”设置下的“设点阅读器”中的“解析性质”选项卡中从小数变为整数。若是软件在某些地区发现不测的峰或信号，可能无法计算RIN值。图3详述提示RNA质量的各地区的电泳图3这将产生提示已检测到异常的错误信息（列在软件的错误选项卡中）。异常包括基因组DNA污染、鬼峰、尖峰和波浪状基线。异常能够分为两类：要点和非要点。非要点异常（如后区的尖峰）将以致计算RIN值

7、，而要点异常（如快速区的尖峰）将以致RIN值无法计算。若是认定某个异常非要点（如基因组污染，此事应当进行DNA酶消化以获得有意义的数据），关于已经标记的样品，还能够经过在“设点阅读器”的高级设置中提高异常阈值设定，计算RIN值（图5）。异常阈值检测的最图4Agilent2100生物解析仪系统Expert软件中的RIN可视化。“结果”选项卡中显示RIN值，而“错误”选项卡将包括在RIN未计算状况下适用的信息图5改变异常阈值和RIN单位小数表示。若是解析时期已经检测到要点异常，则在好多状况下还能够经过提高阈值（最大值为1）计算RIN值。能够在“错误”选项卡中找到关于异常的信息大值为1。错误信息的描

8、述将与适当阈值相对应。利用RIN获得的结果开发RIN软件以除掉依赖用户的RNA质量讲解过程。总RNA样品的表征基本上与仪器、样品浓度和操作者没关，从而赞同跨不相同实验室比较样品。RNA完满性图6显现三份完满程度状态不相同的RNA样品。RIN工具赐予三种不相同命名，代表相应的完满性。在样品与调试算法时所用样品不相同的大型考据研究时期，获得了可靠的样品分类。图6在完满程度不相同的样品上检验RNA完满值。RIN软件算法能够将样品精确分类4核糖体比率图7显示了在三台不相同仪器上解析的同一份人脑(Ambion,Inc.)总RNA样品，并且显示了仪器1和仪器3的代表性电泳图。将采用生物解析仪软件生成的核糖

9、体比率与RIN值比较。关于36份样品，与RIN值相比，采用核糖体比率时变异程度较大。RIN计算值的变异系数为1.4%，而核糖体比率的变异系数为5.1%。切记这些CV值指向相同样品。当纳入来自不相同物种和组织的样品时，发现核糖体比率的CV值显然增大。解析不相同稀释度的样品时，获得了近似图像（图8）。将小鼠脑总RNA稀释为三个不相同浓度：25ng/、L100ng/L和500ng/L。关于测试图7的108份样品中，RIN值大幅度优在三台不相同仪器上解析36份总RNA样品。将RIN与核糖体比率比较。RIN工具的CV显然低于核糖体比率于核糖体比率。RIN的变异系数为3%，而核糖体比率的变异系数则为22%

10、。应当指出，低于25ng/L时，不能够获得正确的RIN值。关于大于50ng/的样品浓度，获得L最佳结果。图8检验不相同稀释程度的同一份RNA样品时，以狭窄限值范围获得相同的RIN值，5而核糖体比率显示重现性差得多利用RINRIN是测量RNA完满性的一款富强的新工具。图9中的图示给出了RIN的最正的确质使用案例。作为第一步，应当考据RIN值（图9A）。这能够经过将RIN值与特定下游实验如微阵列解析或RT-PCR关系来进行。能够利用这个关系步骤在成功的下游实验和失败的实验间建立RIN阈值。能够在现有生物解析仪数据会集（如可获得）进步行此步骤。在已经建立阈值后，这个值能够用于标准RNA质量控制程序（

11、图9B）。RIN高于阈值的所有样品经过QC检验，而扔掉RIN低于阈值的样品。若是重要实验参数改正（比方，研究不相同的生物、使用不相同种类的微阵列、采用不相同的探针集等），则应当重复考据RIN的关系步骤。截至目前，已采用真核生物总RNANano解析法检验RIN算法。RIN限制性RIN旨在供应明确的RNA完满性评估结果。给出了样品完满性的衡量标准，它可用于直接比较运输前后的样品，或用于比较不相同实验室间的样品。最重要的是，它能够用来保证基因表达实验的重复性，只要涉及样品提取步骤。可是，在无先期考据工作的状况下，RIN不能够展望基因表达数据的效能。比方，一份样品可能过分降解而无法进行全基因组微阵列实

12、验，但可能产生良好的RT-PCR数据。为了有效利用RIN，必定进行必要的关系工作。图9A.将RIN值与下游实验（比方微阵列或RT-PCR）关系并确定获得适用基因表达结果的阈值B.在已经进行初始关系实验并已经设定数据阈值后，RIN值能够用于扔掉在Agilent2100生物解析仪系统中未经过样品QC的样品（RIN值低于阈值）6结论我们已经设计出一款能够比核糖体比率更好评估RNA质量的软件算法。RIN工具是RNA完满性评估标准化的重要环节。研究者不再受困于总RNA的主观分类。经过进行关系实验，可创办阈值以保证明验的重复性。已经发现RIN工具基本上没有仪器变异性及浓度变异性，因此有助于仪器间及实验室间

13、样品的比较。参照文件致谢1.我们要特别感谢合作伙伴Ambion“QuantitationcomparisonoftotalRNAInc.、德国基因组研究资源中心usingtheAgilent2100bioanalyzer,ribo-greenanalysis,andUVspectrometry(RZPD)以及QuantiomBioinformatics。”我们还要特别感谢对RIN算法进行（采用Agilent2100生物解析仪、RiboGreen解析试剂和紫外光谱对总内部测试并供应难得建议的所有研RNA进行定量比较），安捷伦应用究人员。简报，初版号5988-7650EN,20022.“Amicr

14、ofluidicsystemforhigh-speedreproducibleDNAsizingandquantita-tion”,Electrophoresis,21(1),128-34,20003.“AdvancingthequalitycontrolmethodologytoassesisolatedtotalRNAandgeneratedfragmentedcRNA”（经过改进质量控制方法评估游离总RNA以及生成的cRNA片段，安捷伦应用简报，初版号5988-9861EN,20037查找当地的安捷伦客户中心：免费专线：800-820-3278，400-820-3278（手机用户）联系我们：在线询价：OdiloMueller是LabChip核酸试剂盒的解析产品经理，SamarLightfoot是核酸解析支持生化专家，AndreasSchroeder