逆转录产品线-小组qa补充rt faq终极版

1、、RNAkeeper与RNAkeeper并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNA keeper 中。、RNAkeeper可以保存细菌吗可以。RNAKeeperRNAKeeper中不能生长，且能保持其完整性。大肠杆菌保存在RNA keeper 中，可 4保存 1 个月。RNA、RNAisolater可以提取miRNA、RNA提取时RNase8离心管必须使用无 RNase 产品或用 DEPC 处理。移液器最好是专用的，用前用 、去离子水/缓冲液一定要用DEPC处理并确保无RNase75%RNaseRNA 降解的（如胰腺组织）或坚硬的组织（如骨骼）、质粒抽提质粒抽提往往用到RNase

2、RNA、RNA 保存即使低温保存，痕量的 RNase 亦会导致 RNA RNA 的最好办法是盐/i)(Ca2Mg2+)在含这些离子时，80加热5分钟会导致RNA被剪切，故如果RNA 需要被加热，保存液需要含适当浓度的螯合剂。、RNA提取RNA的完整性对于后续的qPCR或PCRRNARNA 28S 18SmRNA smear 28S 18S 条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且 28S 的亮度在 18S 条带的一倍以上，我们就可以认为RNA完整性较好，可以用于做进一步的反转录及、RNA、组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA 含量较低；样RNA得率低、RNA 发生降

3、解：如果使用者确定提取 RNA 的试剂/器具没有问题，RNA 的降解通常发生在样品破碎/RNase活性：RNase较低的并且较容易匀浆的组织；2.RNase含量高或不易匀浆的组织，如、RNA、原始组织样本或细胞量太少：提高加入量、RNA发生降解：如果确定提取RNA的试剂/器具没有问题，RNA的降解通、加入异丙醇后室温沉淀 10min 或-20冰箱沉淀 30min 即可，无需过夜沉淀、根据RNA20-40lDEPCRNA有基因组DNA提到上层的水相中，中、下层是有机相，含有氯仿。DNA 即存在于中层。氯仿DNA的污染。吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层，为RNA、纤维组织：心脏/骨

4、骼肌等纤维组织抽提RNA 关键在彻底破碎组织。这些组RNA磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠(因为核酸含量高的缘故)抽提不能有效分层；加入更多裂解液可以解决此问题。多次抽提可以DNADNA解后再次抽提，可以去除 DNA 污染。、RNA建议分装后在-80长期保存。在-20C、逆转录时，10lRNA但是不建议超过 1gRNA 的加入量在 1pg-500ng RNARNA、RNA不会抑制，只是逆转录产物cDNA、逆转录得到的cDNARandom primer因，所以如果后期是扩增基因，则不能加入Random primer。NoRTControl发现有gDNA如果在使用了gDNA

5、wiper后还存在gDNANo RT Control组的 Ct 值来判断实验数据是否可用。当加了模板的阳性实验组 Ct 值比 No RT ControlCt值 5gDNA25倍，由gDNA1/325%，则可以把gDNA污染忽略；若实验组与对照组 Ct 值相差 3 或者几乎一致，则扩增产物的模板来源很大一部分是 gDNA 污染，这样的实验组失去定量意义。、RT-PCR、RT-PCR 是多步反应，应首先检查反应体系。在确认PCR 以及逆转录反应体系没有问题的情况下，RNA 降解是导致实验失败的最主要的原因。可以取少量新鲜提取或冻存的RNA 跑 1%琼脂糖凝胶电泳，检验完整性。以哺乳动物细胞/组织为

6、例，完整的总RNA 在胶上能看见清晰的三条带，分子量从大到小分别为 带或没有条带，则RNA 已完全降解，需要重新提取。、RNA的纯度影响后续反应：RNAisolater基于异硫氰酸胍法，主要杂质来自于异硫氰酸胍等盐的残留，对后续酶反应有很大的影响。因此需要用 75%乙醇（DEPC水配制）仔细洗涤沉淀（轻弹管底让沉淀悬浮，并静置数分钟）、使用T7HighYieldRNATranscriptionKit得到的RNA 如果变性胶上显示RNA条带小于预期大小，则很有可能是由于转录提前终止。转录提前终止分两种情况：1.T7RNA聚合酶的终止序列会导致转录的提前终止，这种情况可以通过降低反应温度到 30以增加全长产物的比例，但同时也会降低总体产量。2.GC或者存在高级结构的模板提高反应温度到 42或者使用单链结合蛋白可能会有助于增加全长产物的产出。、T7 High Yield RNA Transcription Kit试剂盒的转录反应直接产物是单RNARNAiT7