PCR技术及其应用 (2)课件

1、PCR技术及其应用微生物组 lssPCR技术进展PCR工作方式PCR原理DNA结构PCR简史DNA的双螺旋结构AT氢键GC氢键嘌呤嘧啶PCR技术简史1971年，Khorana及其同事提出-修复复制测序、引物合成的困难，Khorana等的早期设想被人们遗忘了设想 PCR技术原理和工作方式PCR的基本原理PCR：Polymerase Chain Reaction 类似于DNA的体内复制退火Primer 1Primer 25355353350Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸72Ta

2、rget SequenceTarget Sequence每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增最后

3、一步 : 72 5-10 min2530个循环后?PCR技术的特点(1) 高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍(2) 特异性引物引物技术流程： 模板获取 引物设计 体系建立 PCR扩增 结果鉴定 体系优化 PCR的实施DNA提取：酚氯仿法全基因组DNA提取：取样组织研磨仪破碎抽提DNA沉淀DNA 核酸提取仪（二）引物的设计 5端引物 3端引物 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度下游53上游编码链1. 引物设计的基本要求：（1）引物长度: 1530 bp（2）碱基 随机（3）单条自身不互补（4）两条引物间不互补全部人类基因组约有2.91G bp，约

4、有39000个基因；平均的基因大小有27k bp2.引物设计软件primer premier 5.0的使用（三）PCR反应体系的建立与条件控制DNA扩增体系（25l） 10Buffer (Mg2+) 2.5l 模板DNA 1l Taq酶（5u/ul） 0.51u dNTP (10mM) 0.51l primer1(10M) 0.51l primer2(10M) 0.51l ddH2O 补齐至25ul经典循环参数（500bp以内）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 5min4 1-2hrPCR仪PCR结果分析1. 凝胶电泳电荷效应DNA带负电分子筛作用凝胶2 成像

5、EB嵌入DNA双链 紫外线照射成像 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 适宜分离的片断：500bp的DNA或RNAPCR产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物后测序。(胶回收)PCR产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，利用连接酶将PCR产物连接到载体如pGEM-T后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。2. PCR产物测序鉴定 ABI prism 310型基因分析仪(即DNA测序仪)是临床检测实验室中使用最多的一种型号 。实用PCR技术定性PCR荧光定量PCR实用PCR技术定性PCR样品模板DNAPCR扩增跑电泳目的片段检出未检出荧光定量PCR实用PCR技术样品模板DNA荧光定量PCR样品中目的片段的拷贝数荧光定量PCR的概念PCR产物荧光物荧光信号检测器曲线TheoreticalRealityLog Target DNA样品拷贝数荧光定量PCR荧光定量PCR非特异性荧光染料法特异性荧光探针法SYBR Green 1Taq man 探针TaqMan荧光探针特异性荧光双标记探针Taq酶 53外切酶活性PCR检测新