《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法

1、第九章 高效液相色谱法（HPLC）2022/10/5第一节 概述第二节 高效液相色谱的基本理论第三节 高效液相色谱的类型第四节 高效液相色谱的流动相和固定相第五节 高效液相色谱仪1. HPLC的特点 一、特点： 高压、高效、高速、高灵敏度分离分析方法。2022/10/5HPLC与GC法比较2022/10/5共同点：（1）气相色谱的理论基本上适合HPLC，如塔板理论、保留值、分配系数、分配比、速率理论等均可应用于液相色谱。（2）定性、定量分析方法完全一样。高效液相色谱也是根据保留值定性，根据峰高和峰面积定量。（3）可与其他仪器联用，用以研究复杂的混合物。2022/10/5不同点：（1）气相色谱法

2、分析对象只限于分析气体或沸点较低的化合 物，它们仅占有机物总数的20%。对于占有机物总数近80%的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，均可用HPLC。（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。（3）气相色谱固定相多是一般固体吸附剂和以硅藻土为担体的高沸点有机液体，成本较低。HPLC固定相大都是新型吸附剂，化学键合固定相。粒度小，成本较高。样品容量也较高。HPLC与GC法比较（4）气相色谱一般都是在高温下进行，HPLC则经常在室温条件下操作。（5）仪器原理及结构也有所差

3、别，高效液相色谱仪具有高压输液泵，色谱柱可以不用恒温箱。检测器的原理和结构与气相色谱也不同。检测器结构要复杂些，灵敏度要低些。（6）由于流动相性质的差别（气体和液体）使得液相色谱的速率理论使用的参数与气相色谱不完全相同。2022/10/52022/10/5高压：HPLC配备了高压输液设备，流动相和进样压力一般可高达14.7 29.4MPa，甚至可高达49.03MPa以上高速：由于流动相速率较快， 流速最高可达10 ml/min. 一般样品的分析时间，可在1h内完成。高效：HPLC应用了颗粒极细（几微米至几十微米直径）、规则、均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。 高灵敏度：配备高灵敏度检测器，

4、使其分析灵敏度比经典色谱有较大提高。2022/10/5第二节 HPLC基本理论涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相 内传质Dm：分子在流动相中的扩散系数；u：流动相的线速度；dp：固定相的粒度；Cm：分配比的函数；Cs：与颗粒孔径中被流动相所占据的分数及分配比有关的数据；Ds：分子在固定液内的扩散系数；df：固定液的液膜厚度。第三节 高效液相色谱法的主要类型及基本原理1、液-固色谱2、液-液色谱3、离子交换色谱4、空间排阻色谱2022/10/5一、液-固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography） 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附

5、与解吸，根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅-镁吸附剂等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极大提高柱效。 但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。 2022/10/5液-固色谱 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 在吸附色谱中，极性大的试样往往采用极性强的洗脱 剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 分离对象：适用于分离相对分子质量中等（300 3000）的油溶性试样，对具有官能团的

6、化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。2022/10/5二、液-液分配色谱（liquid- liquid partition chromatography）固定相与流动相均为液体（互不相溶，极性必须不同）；基本原理：组分在固定相和流动相上的溶解度的不同，即组分在色谱柱中的分配能力不同；固 定 相：由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单.只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。常用的极性固定液,-氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷。2022/10/5二、液-液分配色谱（liquid- liquid partition chroma

7、tography） 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。2022/10/5三、离子交换色谱（ion-exchange chromatography）利用被分离组分对离子交换剂离子交换能力（或选择性系数）的差别而实现分离的色谱分析方法，主要用于离子型化合物的分离分析。2022/10/5三、离子交换色谱（ion-exchange chromatography）固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用

8、酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。 阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3M+H+ 阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4X+OH-应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/10/5四、化学键合相色谱法（CBPC）采用化学键合相的液相色谱法称为化学键合相色谱法。化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。1. 键合固定相类型用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基（S

9、i-OH）与有机分子之间可成键，即可得到各种性能的固定相。一般可分为三类：（1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C18和C8）和苯基等。（2）极性基团：如丙氨基、氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。2022/10/5四、化学键合相色谱法（CBPC）反相键合相色谱法固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37、硅胶-苯基等；流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇-水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液等。固定相的极性 流动相极性分离对象：极性化合物，用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。2022/10/5五

10、、排阻色谱色谱（size- exclusion chromatography）分离原理：尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离。2022/10/5五、排阻色谱色谱 （size- exclusion chromatography）固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原 理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。可对相对分子质量在7102 -1.5 10

11、8范围内的化合物按质量分离。2022/10/5五、排阻色谱色谱（size- exclusion chromatography）流动相：必须溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。2022/10/5六、亲和色谱（Affinity chromatograph）原理：利用生物大分子和固定相表面

12、存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。2022/10/5六、亲和色谱（Affinitychromatograph）生物中许多大分子化合物具有这种亲和特性。例如酶与底物、抗原与抗体、激素和受体，RNA与它互补的DNA等。当含有亲和物的复杂混合试样随流动相流经固定相时，亲和物就与配基结合而与其他组分分离。其他组分先流出色谱柱，然后改变流动相pH值或组成，以降低亲和物与配基的结合力，将保留柱上的大分子以纯品

13、形态洗脱下来。亲和色谱法也认为是一种选择性过滤。它选择性强，纯化效率高，往往可以一步获得纯品，是当前解决生物大分子分离和分析的重要手段。2022/10/5第三节 固定相与流动相一、液相色谱固定相（stationary phases of LC）2022/10/51. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10m以下的小颗粒，涂渍固定液；（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；（2）化学键合固

14、定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN2022/10/5化学键合固定相的特点1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击，提高柱子的稳定性和使用寿命；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；5）有利于梯度洗脱，柱效高。2022/10/52、液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒

15、度：510 m。2022/10/53.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键 合型（键合离子交换基团）树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）2022/10/54. 空间排阻分离固定相（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定

16、性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小， 可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2022/10/5 高效液相色谱分离类型选择 2022/10/5二、液相色谱的流动相（mobile phases of LC）1.、流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2022/10

17、/52.、流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022/10/53、 流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环

18、四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2022/10/54.、选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。不与固定相起化学反应，以免固定相流失。不改变固体吸附剂的吸附活性，不与吸附剂起不可逆吸附。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积，能很好溶解分析试样。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。（5）溶剂粘度小，扩散系数大，以减小传质阻力。

19、2022/10/5第五节 高效液相色谱仪 2022/10/5流 程1.高压输液泵2022/10/5主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2.梯度淋洗装置2022/10/5内梯度（高压梯度装置）将两种溶剂分别用泵增加后，按电器部件设定的程序，用两台泵分别把两种极性不同的溶剂注入梯度混合室混合，再输至色谱柱。外梯度（低压梯度） 溶剂在常温常压下混合，用高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比

20、例抽入高压泵中混合。仅需一台泵即可。2022/10/5梯度淋洗的优点：（1）缩短总的分析时间，可提高分析速度1 19倍；（2）提高分离度；（3）改善色谱峰形状，拖尾少；（4）提高柱效，降低最低检出量。3. 进样装置2022/10/5 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：4.高效分离柱2022/10/5 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。5.液相色谱检测器2022/10/5 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm

21、 ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 5.液相色谱检测器2022/10/5 a. 紫外检测器(ultraviolet photometric detector) 原理：朗伯比尔定律。 优点：应用最广，对大部分有机化合物有响应，灵敏度高，线性范围宽。是高效液相色谱仪的标准配置。它的最重要特征是对流动相的流速（脉冲）和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。其次，流通池可做的很小（1mm10mm ，容积8L)。固定波长汞灯254、280nm,可变波长氘灯200450nm. 光路长510mm。 缺点：对无紫外吸收的组分不响应，而对紫外吸收较大的溶剂如苯不能作流动相使用。 双光路紫外检测器b. 光电二极管阵列检测器2022/10/5 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，