反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究课件

1、皖 南 医 学 院硕 士 学 位 论 文 答 辩 会皖 南 医 学 院硕 士 学 位 论 文 答 辩 会survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究The effect of survivin antisense oligonucleotide on apoptosis of HL-60 cells研 究 生 : 陈艳萍 导师 : 毕富勇 副教授汪萌芽 教 授 学科专业 : 生理学 研究方向 : 肿瘤生化 survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究The 前 言1997年耶鲁大学的Altieri博士用EPR-1的cDNA在人类基因组库的杂交筛选实验中发现了一段15kb大小的基

2、因片段，它编码了142个氨基酸组成的Survivin蛋白；Survivin的编码基因位于染色体17q25，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员前 言1997年耶鲁大学的Altieri博士用E Structure of human IAP protein family17q25BIR: baculoviral IAP repeatRZF: ring zinc-fingleCARD: caspase recruitment domainInhibitor of ApoptosisLocation in human chromosome Structure of humaSurvivin分子结构长螺

3、旋 BIR区 Survivin分子结构长螺旋 BIR区 Survivin分子结构长螺旋 BIR区 Survivin分子结构长螺旋 BIR区 Survivin分子结构Survivin形成二聚体Survivin分子结构Survivin形成二聚体Survivin表达肺癌肝癌膀胱癌皮肤癌神经母细胞瘤乳腺癌食管癌胃癌白血病Survivin表达肺癌肝癌膀胱癌皮肤癌神经母细胞瘤乳腺癌Survivin表达SURVIVIN选择性表达于绝大多数肿瘤组织在正常成人分化组织中不表达（包括癌旁组织）普遍性独特性 Survivin表达SURVIVIN选择性表达于绝大多数肿瘤Survivin作用!Survivin作用!Su

4、rvivin作用Survivin抗凋亡肿瘤细胞分裂增加凋亡减少Survivin作用Survivin肿瘤细胞分裂增加凋亡减研究内容研究内容反义Survivinsurvivin表达受抑活化细胞凋亡反义Survivinsurvivin表达受抑活化细胞凋亡技术路线技术路线HL-60细胞体外悬浮培养掺入反义寡核苷酸48 h 后分别于24h、48 h形态学观察、死活细胞计数 收获细胞、检测指标RT-PCRTUNELFCMHL-60细胞体外悬浮培养掺入反义寡核苷酸48 h 后分别于材料 细胞株HL-60细胞株（急性早幼粒细胞系）由中国科学院上海细胞所提供 材料 细胞株RNAgents Total RNA I

5、solation System Promega公司AccessQuickTM RT-PCR System Promega公司Propidum Iodide (PI,碘化丙啶) Sigma公司主要药品与试剂材料主要药品与试剂材料研究方法 研究方法 反义寡核苷酸的序列 survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸(Aspo )序列 5GGCAACGTCGGGGCACCCAT39 非特异性对照硫代寡聚脱氧核苷酸(Nspo)序列 5GCCATCGTAGGGGATCGCTT39 上海SANGON公司合成与纯化 反义寡核苷酸的序列 survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸( 培养箱 20%新生小牛血清 RPMI-

6、1640液 100U/ml青霉素 100 ug/ml 链霉素 37oC 5%CO2饱和湿度 倒置显微镜观察 23天传代一次 细胞系的培养和传代 HL-60细胞 培养箱 20%新生小牛血清 RPMI-1640液 100UPhoto1.HL-60 cells（100）Photo1.HL-60 cells（100）Tab1.The experiment grouping group factor concentrationControl RPMI-1640 mixtureNspo Nspo 15.0umol/L Aspo5.0 Aspo 5.0umol/L Aspo10.0 Aspo 10.0umo

7、l/L Aspo15.0 Aspo 15.0umol/LTab1.The experiment grouping g实验分组及寡核苷酸的掺入1000r/min离心5minRPMI-1640洗1次 细胞起始浓度4106/ml 取细胞悬液1000ul接种至24孔板 核酸100 ul 置CO2培养箱中孵育 HL-60细胞 实验分组及寡核苷酸的掺入1000r/minRPMI-1640细胞增殖能力及活力观察 HL-60细胞于24、48h 取50 ul细胞悬液 0.4%台盼蓝染色 计数死活细胞 着色为死细胞拒染为活细胞 计算细胞存活率细胞增殖能力及活力观察 HL-60细胞于24、48h 取50细胞增殖能力

8、及活力观察细胞增殖能力及活力观察HL-60细胞survivin mRNA的表达总RNA的提取 HL-60细胞survivin mRNA的表达总RNA的提取细胞沉淀加入300ul D液 加入30 ul Sodium Acetate 加入苯酚:氯仿:异戊醇300 ul 冰浴 15min 10000g4离心20min 转移上清 加入等量异丙醇 20放置10min 10000g4离心10min 75%冷乙醇洗涤RNA10000g4离心10min 以无RNase的纯水溶解沉淀 RNA纯度检验和定量 RNA细胞加入300加入30 ul Sodium Acetate HL-60细胞survivin mRNA

9、的表达 RT-PCR HL-60细胞survivin mRNA的表达 RT-PCR反应体系50l48延伸45min 95预变性 2 min PCR循环 95 45sec 61 1 min 72 1min共30个循环 72延伸 5min 模板RNA 1 ul AMV逆转录酶 1 ul上游引物 3 ul下游引物 3 ul AccessQuickTM Master Mix 25 ul 反应体系50l48延伸45min 95预变性 2 miTdt 酶介导的缺口末端标记法 具体操作按试剂盒说明书进行 结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞 凋亡细胞指数=凋亡细胞数 细胞总数 100%Tdt

10、酶介导的缺口末端标记法 具体操作按试剂盒说明书进行凋DNA倍体分析及凋亡率的检测 实验流程DNA倍体分析及凋亡率的检测 实验流程单细胞悬液不含Ca2+或Mg2+的PBS洗细胞 2次 1000g离心5min弃上清 计数细胞总数 500l PBS重悬 5ml冷乙醇 4过夜 离心洗细胞2次含1%小牛血清的800lPBS重悬避光孵育1h 100l煮沸过的RNA酶A 37 30分钟 FCM分析 加入100l PI单细胞悬液不含Ca2+或Mg2+的PBS洗细胞 2次 100统计分析 结果均以“均数标准差”表示，组间比较用单因素方差分析，以P0.05确定有显著性意义。统计分析 结果均以“均数标准差”表示，组

11、间比较用单因素结果(1)细胞增殖能力及活力观察结果(1)细胞增殖能力及活力观察Tab2. Effect of Aspo on HL-60 cells survival rate (xs, n=3)* p0.05, * p0.01 vs Ccontrol, p0.05, p0.01 vs Nspo Group Survival rate (%) 24 h 48h Control 98.70 0.70 98.28 0.45 Nspo 98.59 0.60 97.47 0.47 Aspo5.0 96.77 0.47* 95.05 0.24*Aspo10.0 92.63 1.16* 89.08 1.2

12、0* Aspo15.0 82.61 0.85* 77.71 0.77* Tab2. Effect of Aspo on HL-60Fig1. Effect of Aspo on HL-60 cells survival rate (xs)Fig1. Effect of Aspo on HL-60结果(2)TUNEL法检测的HL-60凋亡细胞及其凋亡指数结果(2)TUNEL法检测的HL-60凋亡细胞及其凋亡指数Photo2.control group (DAB400) Photo2.control group (DAB400)Photo3.Nspo group(DAB400) Photo3.Ns

13、po group(DAB400) Photo4.Aspo5.0 group (DAB400) Photo4.Aspo5.0 group (DAB400)Photo5.Aspo10.0 group(DAB400) Photo5.Aspo10.0 group(DAB400)Photo6.Aspo15.0 group(DAB400)Photo6.Aspo15.0 group(DAB400)GroupApoptotic index(%) P C NControl 2.16 0.29Nspo 2.21 0.25Aspo 5.0 4.77 0.42 * Aspo10.0 10.63 0.99 * Aspo

14、15.0 21.67 1.95 * * p0.05, * p0.01 vs Ccontrol；p0.05, p0.01 vs NspoTab3.Apoptosis index of HL-60cells (xs,n=3 )GroupApoptotic index(%) 结果(3)Aspo处理HL-60细胞survivinmRNA表达的变化 结果(3)Aspo处理HL-60细胞survivinmRNAFig2. survivin mRNA expression of HL-60 cells treated by Aspo for 48 hours detected by RT-PCR1:100

15、bp DNA ladder ; 2:Control; 3: Nspo group; 4:Aspo5.0 group ; 5: Aspo 10.0 group ;6 :Aspo 15.0 group.Fig2. survivin mRNA expressTab4.effect of Aspo on survivin mRNA expression of HL-60 cells (xs,n=3 )* p0.05, * * p0.01 vs Ccontrol；p0.05, p0.01 vs Nspo Groupsurvivin/-actinPC NC NspoAspo5.0Aspo10.0Aspo1

16、5.00.8120.0060.8180.0050.7800.0050.5980.0080.4960.012* * * * Tab4.effect of Aspo on survivi结果(4)流式细胞仪凋亡率的检测结果(4)流式细胞仪凋亡率的检测Tab.5 Effect of different doses of Aspo on HL-60 cells apoptosis (xs,n=3 )* p0.05, * * p0.01 vs Ccontrol；p0.05, p0.01 vs Nspo GroupApoptosis rate(%)PC NC NspoAspo5.0Aspo10.0Aspo

17、15.01.090.491.620.342.670.565.750.9019.800.30* * * * Tab.5 Effect of different dosFig.5 Apoptosis peak measured by flow cytometry of HL-60 treated with survivin Aspo A:control B: survivin Nspo C: survivin Aspo Fig.5 Apoptosis peak me讨 论 讨 论 细胞凋亡机制的研究进展： 细胞凋亡:又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）由Casp

18、ases（即含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶）家族成员介导的蛋白酶级联反应过程 凋亡机制细胞凋亡机制的研究进展： 细胞凋亡:又称程序性细胞死亡（pr 凋亡提呈:驱动性Caspases 凋亡实施:效应性Caspases凋亡机制 凋亡提呈:驱动性Caspases 凋亡机制Survivin与白血病的关系 Survivin在各种白血病中均有表达，随着病情的缓解survivin表达也降低。且有研究发现survivin低表达的白血病患者，其完全缓解率及存活率高，而 survivin高表达患者不易缓解，且易复发 survivin mRNA表达与白血病诊断、治疗转归及预后判断密切相关Survivin与白血病的

19、关系 Survivin在各种白血病急性早幼粒细胞白血病的简介白血病是常见的恶性肿瘤之一，发病率2.7610万。 在恶性肿瘤的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下成人中则居第 1 位 26 急性早幼粒细胞白血病（APL）的构成比约占急性白血病的1015% 其临床特征之一是严重出血，因此早期病死率高。 急性早幼粒细胞白血病的简介白血病是常见的恶性肿瘤之一，发病率急性早幼粒细胞白血病的治疗现状联合化疗： 缓解率可达6080%非特异性细胞毒性，抑制患者造血功能和免疫功能 其毒副作用不但造成患者治疗的相关性死亡，而且影响其“治愈”剂量的临床应用。此外，由于白血病细胞对化疗

20、药物的耐药，多数病人最终复发。 随着分子生物学技术的发展和对白血病发生、发展分子机理认识的深入，使白血病的研究进入了基因治疗新阶段。 急性早幼粒细胞白血病的治疗现状联合化疗： 缓解率可达608Survivin 作为靶基因的思考作为白血病反义治疗的理想靶基因必须具备以下两个条件： 在肿瘤发生过程中起关键作用； 只有在肿瘤中表达，而在正常组织中不表达。 survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性 Survivin作用于细胞凋亡中的关键酶 -Caspase-3 Survivin表达的普遍性和独特性 Survivin 作为靶基因的思考作为白血病反义治疗的理想靶细胞凋亡诱导物病毒感染射线D

21、NA损伤死亡信号survivin活化Caspase-3细胞凋亡Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是细胞凋亡中的关键酶，而本试验所选取的survivin基因能直接或间接抑制Caspase-3的活化，所以具有强大的抗凋亡作用由于survivin抑制细胞凋亡的功能活性在肿瘤的发生、发展中起关键性作用，survivin在白血病细胞的重新表达可能是促成白血病发生的重要因素，survivin 可能是一种新的癌基因 细胞凋亡诱导物病毒感染死亡信号survivin活化Caspa反义核酸序列的选定针对survivin基因的翻译起始密码子和前几位编码序列设计并合成的 磷酸二酯键受核酸酶作用，容

22、易被降解，虽能用病毒载体将其转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，采取的是对磷酸二酯键的磷原子进行硫代修饰，硫代磷酸寡核苷酸有好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导 RnaseH 反义核酸序列的选定针对survivin基因的翻译起始密码子和survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用凋亡特征TUNEL法能在3，-OH末端通过产生很强的颜色反应（棕褐色）准确定位凋亡的细胞；特异性高，敏感性强，可量化凋亡细胞。细胞凋亡时染色体断裂，DNA被裂解，细胞膜通透性增加，在细胞洗染过程中，DNA碎片逸出，胞内DNA含量明显降低，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性的亚二倍体峰，即凋亡峰。survi

23、vin对HL-60细胞的凋亡诱导作用凋亡特征凋亡的DNA断裂特征性变化是内源性核酸酶的激活将DNA双螺旋结构由核小体间连接区断裂，形成以180210bp或其多聚体组成的寡核苷酸片断，从而产生3，-OH末端。凋亡的DNA断裂特征性变化是内源性核酸酶的激活将DNA双螺旋经Aspo处理后的HL-60细胞经TUNEL染色均可见到阳性凋亡细胞，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性的亚二倍体峰，表明survivin Aspo能够特异性诱导HL-60细胞的凋亡, RT-PCR实验显示本实验所选取的这段反义核酸特异性的抑制survivin基因的表达，提示可能由于降低了HL-60细胞内survivin mRNA的含量 ，从而诱导HL-60细胞的凋亡 survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用经Aspo处理后的HL-60细胞经TUNEL染色均可见到阳survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用台盼兰拒染试验、TUNEL凋亡指数的分析与流式细胞术所检测出的细胞凋亡率均提示Aspo浓度的不同，所导致的细胞凋亡程度亦有不同,随着Aspo浓度的升高，细胞