中科大FPLC使用参考

1、FPLC使用指南From:USTC|Date:2016-12-01简介（INTRODUCTION）FPLC全称为迅速蛋白液相色谱（Fastproteinliquidchromatography），其原理与高效液相色谱理论近似，是由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，而且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采纳高敏捷检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。我们实验室有两套纯化仪，一台是AKTAprimeplus（侧重介绍），此外一台是AKTApureprotein(简单介绍）。AKTAPure纯化系统（详见AKTAPureonsite-training）AKTAPrimeP

2、lus纯化系统安全(Safety)组件(Components)方法编程(Methodprogramming)使用方法(Usage)保护注意事项(Maintenance)安全(Safety)警示！系统一定与接地电源插座连结。警示！用户不可以翻开系统，由于系统含高压电路，会造成致命的电击。3.警示！一定总有上样环连结在上样阀的接口2和6。这是为了在变换此阀时防备液体从这些接口喷出。特别是使用危险化学品时，这是特别危险的。警示！假如有大批溢出的液体渗透系统外壳并同带电零件接触的危险，应立刻封闭系统并同指定的技术服务人员联系。警示！NaOH有害健康，应防止泄漏。组件（Components）AKTApr

3、imeplus蛋白质纯化系统包含以下零件：1.缓冲液阀和梯度变换阀：缓冲液阀用于(Buffervalveandgradientswitchvalve)选择使用缓冲溶液，用于系统泵施加大的样品体积。梯度变换阀用于成立梯度。系统泵(Systempump)：系统泵用于经系统运送液体，如样品或缓冲溶液。将液体经缓冲液阀、梯度变换阀或经上样阀进入流动通道。压力传感器(Pressuresensor)：压力传感器能够丈量在位液体压力。还可用作压力保护装置。混淆器(Mixer)：混淆器用于混淆两元梯度。以两步将溶液混淆以获得最适合的结果。混淆器的体积能够选择。上样阀(Injectionvalve)：上样阀用于

4、装加样环和用于将样品注射到柱上。6.检测器(Monitor)：检测器的目的是丈量流出柱后液体的UV汲取、电导率和pH（任选）。用于这些丈量的流动池安装在系统的右边。7.拥有分流阀的分部采集器(Fractioncollectorwithflowdiversionvalve)：分部收集器用于将样品组分采集在管中供进一步剖析。分流阀在废液和采集管之间变换流向。?方法编程（Methodprogramming)主菜单纲要该菜单出此刻自检后启动时，用于运行予制的应用Template模板和法模板。RunstoredMethod用于运行用户编写的运行方法ManualRun用于不使用方法,手工运行系统。Prog

5、ramMethod用于编写用户专用方法。用于对检测紫外(UV)、电导、pH、温度、和运行泵SetParameters及混淆器设置参数。用于检测系统内部参数，比如序列号、泵运行时间、Check和灯亮度。?使用方法（Usage)利用洗脱镍柱中的蛋白（以5mL镍柱为例）AKTAPrimePlus翻开AKTA（机器背部左下角），将A泵和B泵用蒸馏水冲刷洁净分别插入到Ni-bindingbuffer和Elutionbuffer中，并在Template中选择systemwash，洗泵(大体五分钟）。2.systemwash完成后，先选择manualrun，%B=0，pressurelimitation=M

6、Pa，流速=1ml/min。先将Ni柱底部接到探测器上，再将1号接线口接到镍柱上端（这样能够防备绿色线管歪曲），察看电脑屏幕待UV线、电导线平齐时Endprogram。3.设定程序：流速3ml/min，limitpressure为MPa设定breakpoint：0ml：%B=4，setfractionsize=020ml：开始拉梯度，%B=4；开始采集样品，setfractionsize3ml/tube80ml：%B=60；同时也向来在采集样品，setfractionsize3ml/tubeml：%B=60（有时有些蛋白量很大或许延时出来，能够设这个程序，以防万一），setfractionsi

7、ze3ml/tubeEnd蛋白纯化结束后，要冲洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵和B泵用蒸馏水冲刷洁净插入到蒸馏水中，并在Template中选择systemwash，洗A、B泵。用蒸馏水冲洗完成后假如长久不用机器，需要用20%酒精再次冲洗系统泵。并将采集器上的玻璃管整理洁净，并用水冲洗，放于管架晾干。（总之，意思就是：0ml时所有的系统所有要求置零，0-20ml区间跑4%elutionbuffer把杂蛋白洗下来。20-80ml区间设定elutionbuffer的浓度从4%慢慢升到60%同时采集样品，80-100ml区间用60%把节余蛋白所有洗脱下来并采集样品，抵达100ml时停止。

8、）蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面翻开primeviewevaluation软件，打来文件夹，在里面依据时间次序找到你蛋白质纯化图谱，而后点击file，选择saveas将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择exportcurves选择01：UV和06：Conc并在Reducenumberofsamples中选择Reduceby1。点击保存，获得excel表格，并用Graphpadprism5做蛋白纯化图谱。重点步骤：提早看好转盘与滴液体的部分能否靠紧，不然不会自动采集样品。2.依据出来的峰对应的离心管取下来放在冰上，取至管，暂放60lmlEp在冰上，用于制备S

9、DS样品。3.依据峰的地点选择样品，一般会有30ml左右，加入1mMEDTA和2mMDTT以及PMSF，下边的gelfiltration能够用superloop上样。万一电脑显示器上不更新图谱了，可能是与电脑的连结断了，需要关了纯化仪，重启。样品采集器有时会出现跳管子的状况，受样品是要注意从头或从尾对一下管子。跑其余柱子也是一样。不要用蛮力摇动输送臂。松开固定输送臂按纽，并将臂高升。（如图示）实时清理废液。（特别留宿纯化蛋白时，要检查废液能否装满）利用AKTAPrimePlus过分子筛1.翻开，将A泵用蒸馏水冲刷洁净插入到gelfiltrationbuffer中，并在AKTATemplate中

10、选择，洗泵大体五分钟）。并用gelfiltrationbuffersystemwash(手动或许程序设定冲洗上样环。2.systemwash完成后，先选择manualrun，%B=0，pressurelimitation=MPa，流速=2ml/min(依据不一样分子筛设定流速）。先将AKTA上1号接线口湿接上部分子筛，此时察看柱子管道能否有气泡，假如有气泡那么应当将1号接口线湿接到分子筛尾部接口，待分子筛头部管道空气排清后再正过来接柱子，最后将柱子尾部接口接到探测器上。察看电脑屏幕待UV线、电导线平齐时Endprogram。Superloop接上，6号出口线接superloop上边，下边出来接

11、上2号口。设定程序（以30ml样品和320ml分子筛为例）：流速：2ml/min，限压：MPa，A为gelfiltrationbuffer，全程。%B=0ml：injectml：load100ml：load，setfractionsize=8ml/tube（此处的breakpoint体积以各自的蛋白大小而定）400ml：load，setfractionsize=0End蛋白纯化结束后，要冲洗AKTA泵内部溶液，方便下位同学使用，将A泵用蒸馏水冲刷洁净插入到蒸馏水中,并在Template中选择systemwash，洗泵。蛋白质纯化图谱的保存与提取（1）保存：在电脑桌面翻开primevieweva

12、luation软件，打来文件夹，在里面依据时间次序找到你蛋白质纯化图谱，而后点击file，选择saveas将你的图保存在你的文件夹。（2）提取：点击file,选择export选择：和06：并在中选curves01UVConcReducenumberofsamples择Reduceby1。点击保存，获得excel表格，并用Graphpadprism5做蛋白纯化图谱。重点步骤：superloop上尽量不要有气泡，假如有气泡只好跟过镍柱同样快跑完时手动调成load。所有参数在跑的过程中都能够变动，所以固然程序上接样是从100ml-400ml这么宽的范围进行采集，但依据实质状况能够自己调。2.Supe

13、rloop中的样品假如只有30毫升，在设定程序时需要有所保存设定为29毫升，免得分子筛里进入气泡。在使用绿色上样管时，请用注射器汲取少许gelfiltrationbuffer，打入到绿色上样管中(一是为了去除气泡，而是为了去除管内液体）。?保护注意事项（Maintenance)每日，除了连续使用外，当实验达成系统使用结束后，应尽可能防止保存在装载缓冲液状态留宿。尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！若是，不可以防止，则紧记第二天尽早用SystemWashMethod达成以蒸馏水将系统完全冲洗，才予以保存或再更新使用其余缓冲液，再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将剩下的缓冲液完全冲刷出系统，这步骤至关重要

14、。此举不只好够防止缓冲液对系统造成腐化时机，或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的拥塞，对系统组成不用要的伤害和消耗。（我们机器没有pH探测器）任何时间当不使用系统时，绝不要将pH电极留在流动池里。请不该将电极以水保存，不然这将使电极尾端的玻璃膜，因长期保持于工作狀况下，会加快老化，甚或变干。电极可作以下办理：从流动池卸掉pH电极。先以蒸馏水冲刷一遍，轻拭水份后，使其尾端以其适合溶液泡浸保存。建议使用之保存溶液为：1摩尔KNO3及pH值为4溶液（以1：1）的混淆缓冲液。3.若数天或更长的时间不使用系统，除用蒸馏水完全冲洗系统外。取下柱和pH电极（任选件）。经过细管道替代柱，并安装虚构pH

15、电极（假如使用）。而后用20%乙醇再冲刷所有使用的管件通道和所有的流动池一遍，而后并以此将系统保存。(pH电极应先行办理，参看上边2节的说明）。UV流动池也能够如上所述地用蒸馏水冲刷而后用20%乙醇经过流动池。但如需要也可吹乾寄存，从头搁置上红的保护罩。在此其实不建议使用压缩空气使之吹乾，由于其内可能含有油滴，造成污染。建议使用低压高纯氮气或憜性气体（如氩气等）。每个月按期养护办理，或当发现假峰等问题出现时，可拆下柱子，并用适合的毛细管道替代其地点，将所有的缓冲液进口管件置于1摩尔NaOH中，对所有的进口管件通路运行SystemWashMethod，以流速为每分钟1毫升，将整个系统充分冲刷若20分钟。而后立刻用蒸馏水，以通条件将整个系统运行SystemWashMethod加以冲刷20分钟。当装置部分采集器出口管架时，应依据采集管的长度不一样而使用不一样的切换口。调整时可将出口管和管夹放在输送臂上的长度导向小孔上，将管夹底在孔外臂上，将出口管轻推向下抵达导向孔的底部，而后上紧管夹螺母。此可保证出口管露出正确的长度，免得造成跳管或采集体积错误状况发生。必定要保持实验环境的洁净，当使用仪器时发现缓冲液的泄漏或看见机