逆转录聚合酶链反应中的细节问题课件

1、逆转录聚合酶链反应中的细节问题RT-PCR原理实验器具与材料试剂 标本收集与保存 RNA抽提逆转录反应(RT)聚合酶链反应（PCR)介绍内容一、实验器具、材料1、移液枪：1ml、200l、20l2、吸头及吸头盒：1ml、200l、20l （无菌无酶，可直接购买）3、EP管：1.5ml （无菌无酶，可直接购买）4、PCR薄壁管 0.2ml 5、普通EP管：1.5ml、O.5ml（高压灭菌） 6、大瓷缸：2个 （180的高温干烤6h，灭活RNA酶，存放无酶EP管和PCR管） 7、组织捣碎棒（可直接购买）1、DEPC水 500ml。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放4保存3、异丙醇4

2、、氯仿5、电泳缓冲液(TAE/TBE)7、琼脂糖8、Taq酶（含MgCl2 Buffer）,-20 9、dNTP ,-20 10、随机引物,-20 11、M-MLV逆转录酶 (Buffer) ,-20 12、RNasin ,-20 13、Trizol 100ml/1瓶 ,-4 14、Marker, -20 15、引物,-20 二、试剂四、RNA抽提 目的：防止RNA被RNA酶降解，获得高质量的RNA措施：1.了解RNA酶的来源及应对方法：（1）内源性：组织细胞裂解释放（低温、RNA酶抑制剂）（2）外源性：实验者的皮肤分泌物、呼吸气体、唾液等（带手套、口罩）；（3）实验环境中的灰尘、微生物等（环

3、境清洁、消毒、在超净台内进行）；（4）实验器械（进行无酶处理）：180的高温下干烤6h；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具不能使用）；用DEPC处理过的无菌双蒸水配制溶液。 2、了解RNA抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意RNA酶污染的关键步骤，做到胆大心细。举例如下：TRI REAGENT 分离RNA PROTOCOL1）510106细胞沉淀，加TRI Reagent 1ml,反复吹打将细胞溶解。 50 - 100 mg 组织加 1 ml TRI Reagent于匀浆器中匀浆 （注意：标本体积不得超过TRI Reagent 体积的10% ）2）将匀浆于室温静置 5 分钟

4、（此步后将样本置-80 至少可保存一个月）3）然后向匀浆中加 入0.2 ml氯仿, 盖紧样本剧烈振摇15秒4）将混合物室温静置 2-15 min，12,000 g ，4离心 15 min （低温离心很重要，否则，水相中会混入少量的DNA）(离心后原混合物分为底层红色的 酚氯仿相, 中间相和上层无色的水相。 RNA 存在于水相，而DNA 和蛋白质分别存在于中间相和有机相。水相的体积大概占用于匀浆的TRI Reagent总体积的 60%。)5)转移上层无色的水相至新的管子中,加 0.5 ml异丙醇（从水相中沉淀RNA），室温静置 5-10 分钟6) 12,000 g，4 离心 8 min. 此时可

5、见RNA 沉淀(离心前通常看不见) 于管底或侧壁形成胶冻状或白色沉淀。3、RNA质量检测1）检测RNA溶液的吸光度 OD260/OD280 = 1.82.0表示优质（ 280、260nm下的吸光度分别代表了核酸、和蛋白值），并可以检测浓度;2）RNA的电泳图谱：检测28S和18S条带的完整性和他们的比值。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，RNA的质量是好的;3）保温试验（检测有无微量RNA酶残留）4)直接逆转为cDNA，进行管家基因（如b-actin）PCR，琼脂糖电泳后，如有相应的产物条带，则说明RNA可以使用5、RNA保存：-80 冻存；或逆

6、转为cDNA保存（更安全）4、DNA污染的检测与处理1）检测方法： a:用没有逆转录的RNA产物进行PCR，有产物生成，提示污染 b:设计上下游引物，使其与DNA互补位点之间包含内含子，来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短 2）处理：在逆转录之前使用扩增级的DNase对RNA进行处理 五、逆转录反应 目的：以RNA为模板，逆转录合成cDNA措施：1.获取优质的RNA;2.采用优质的逆转录酶 AMV(禽成髓细胞瘤病毒)：逆转录酶和RNA酶H活性。最适42。 MMLV(Moloney 鼠白血病病毒)：逆转录酶活性强，RNA酶H活性较弱。最适37或42。 3.引物选择:随机

7、引物:适用于长的或具有发卡结构的RNA,特异性最低;。 Oligo(dT)：适用于具有PolyA尾巴的RNA 特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况 4、质量检测：进行管家基因（如b-actin）PCR5、产物保存：-20 First-Strand Synthesis of cDNA举例1.试剂(1) M-MLV Reverse Transcriptase (200u/ul) （promega，Catalog#M1701)(2) M-MLV 5Reaction Buffer(3) rRNasin (40u/ul) （promega）(4) dNTP(10mM ea

8、ch) （生工）(5) Random Primers （生工）(6) Nuclease-Free Water2.操作步骤（1)Total RNA2 ugPrimer (0.5ug/ul)2 ul Note: 0.5ug/ug mRNANuclease-Free Water11 ulAdd to 15 ul70 ，5分钟以溶解模板的二级结构，取出立即置冰上冷却（防止二级结构重新形成），简单离心。六、聚合酶链反应（PCR) 目的：以cDNA为模板大量扩增目的基因片段措施：1.合适的PCR引物;2.合适的Taq酶；3.PCR条件的优化PCR引物设计原理 用Primer Premier 5.0进行引物

9、设计举例 以大鼠olig2的引物设计为例1、查找大鼠olig1 mRNA碱基序列2、用Primer Premier 5.0进行引物设计四种重要指标：发夹结构(Hairpin)、二聚体(Dimer)、错误引发情况(False Priming) 、上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer) Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 34、引物同源性分析（用Blast进行同源性比较） 检查引物的特异性3、Primer Premier 5.0设计的大鼠olig2引物5、Blast进行同源性比较，确认引物的特异性

10、后，联系公司，合成引物6、引物的溶解和稀释上下游引物干粉各加适量消毒双蒸水(灭菌注射用水)稀释至20M, -20保存.PCR举例注意：此PCR反应条件中缺预变性（94，5min)和最后的产物延伸（72 ，10min)DNA琼脂糖凝胶电泳 准备试剂：1电泳缓冲液：(TBE或TAE均可）(1)5TBE:Tris 54 g Boric Acid 27.5 g0.5molL EDTA 200 mL pH=8.0定容至1000 ml。 (2)50 xTAETris 242 g冰醋酸 57 mL0.5molL EDTA 200 mLpH 8.0 定容至1000 ml。 2凝胶加样缓冲液(6)3琼脂糖 4溴

11、化乙锭溶液(EB) 10mgmL 5DNA 分子量Marker实验步骤 配胶（1琼脂糖凝胶）0.3 g 琼脂糖加入30 ml 0.5TBE中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60，加入3l的EB，并摇匀. 制胶：把梳子插入制胶槽相应位置，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，垂直向上拔出梳子，将凝胶连同胶槽置入电泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。(3) 点样：用移液抢吸取PCR产物5l于塑料纸上，再加入1l 的6加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 (4) 电泳：（由负极向正极电泳）打开电源开关，调节至合适电压(一般电场强度不要超过5Vcm )；可见到溴酚蓝条带

12、由负极向正极移动，电泳约15min-30min。(5)观察：关掉电源，将凝胶小心的从电泳槽中取出，置于紫外透射检测仪上观察，拍照，并分析。PCR反应条件的优化（一）PCR反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子1050mmol/L Tris-HCl缓冲液50mmol/L KClBSA或明胶（二）镁离子浓度Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。一般常用1.5mmol/L三）底物浓度dNTP浓度在20200 mol/L四种dNTP必须浓度相等（四） Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性（五）引物引物浓度一般为0.1 0.5mol/L（六）反应温度和循环次数变性温度和时间 95/30 60s退火温度和时间 4555/30 60s延伸温度和时间 72 60s循环次数 2530 不超过35PCR反应中可能出现的问题：假阴性，不出现扩增条带假阳性出现非特异扩增带预防措施（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作