贵州野生天麻遗传多样性的AFLP指纹分析

1、贵州野生天麻遗传多样性的AFLP指纹分析【摘要】目的研究野生天麻的遗传多样性，为合理利用野生天麻种质资源、为天麻的进一步系统选育研究提供一定的理论根据。方法利用AFLP技术，采用8对+3和P+3引物组合对23份贵州野生天麻品种进展了总基因组DNA程度上的多态性检测，用NTSYSp-2.10s软件的UPGA方法对检测结果进展聚类。结果共获得552条可统计的条带，其中396条呈多态性，多态性带百分率约72%。UPGA聚类可以将贵州不同产地的野生天麻很好地区分开来。结论该实验提醒了贵州野生天麻种质丰富的遗传多样性，聚类分析结果说明多数来源地一样的天麻种质表现出较为亲密的亲缘关系。【关键词】野生天麻；

2、遗传多样性；AFLPAbstrat：bjetiveTstudythegenetiplyrphisfildGastrdiaelataBl.inGuizhuprvine,andprvidereferenefrtheutilizingitsgerplasresuresandultivatingnevarieties.ethdsThephylgentirelatinshipsang23ildGastrdiaelataBl.inGuizhuereanalyzedusingAFLPtstudythegenetidiversityithEightAFLPprierbinatins(+3andP+3).The

3、deterinedleulararkersereanalyzedthrughUPGAethdfsftareNTSYSp-2.10s.Results552bandseredeteted，396fhihereplyrphi,andthehighratifplyrphibands(86%)erebservedinthisstudy.ThedendrgrafrthelusteringfUPGAshedgdlassifiatinfallppulatin.nlusinurresultssuggestthatildGastrdiaelataBl.inGuizhushsabundantgenetidivers

4、ities.ResultsflusteranalysisshedthatthelassifiatinbasednAFLParkersfildGastrdiaelataBl.inGuizhuisnsistentiththEIrrigin.Keyrds：ildGastrdiaelataBl.；Genetiplyrphis；AFLP天麻为兰科(rehidaeae)多年生草本植物天麻GastrdiaelataBl.的枯燥根茎，为我国传统名贵中药。其主要有效成分天麻素具有广泛的药理作用,具有镇静催眠、抗惊厥、增智、健脑、治疗老年性痴呆症、抗氧化、延缓衰老、增强免疫功能、调节心血管等作用。就天麻遗传学研究

5、来看，传统的研究主要是从形态学方面进展研究。近年来研究主要是运用RAPD1,2，AFLP2，ISSR3等分子生物学技术对其遗传进化、品种分类鉴定等方面进展研究。野生天麻作为一种重要的遗传种质资源，未见有对其遗传多样性进展研究的报道。本研究利用AFLP技术,以8对引物对23株不同来源的贵州野生天麻基因组DNA进展分析,旨在从分子程度上认识贵州天麻野生资源的遗传多样性和其遗传亲缘关系,为天麻种质资源的搜集保存和有效利用提供理论根据。1仪器与材料1.1材料样品采自贵州不同地区或一样地区的不同居群，均为野生未受人为干扰状态下生长，详细类型和分布见表1；所有样品经贵阳医学院药学院生药学教研室王晓丽教授鉴

6、定。表1样品编号分类及产地略1.2仪器与试剂试验中用se、Pst、ER、T4DNAlingase、RNA酶试剂来自NEB公司，丙烯酰胺SIGA、聚丙烯酰胺SIGA，接头和引物由上海生工生物公司合成，Taq酶、dNTP来自大连宝生物公司。DY2-20型电泳槽、DYY-12型电泳仪北京市六一仪器厂，PR仪TEHGENE,其余为国产分析纯试剂。2方法2.1基因组DNA制备47新颖采集的天麻块茎或地上茎切成小块后用改良的TAB法提取基因组DNA，用0.8的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用核酸蛋白测定仪测定DNA浓度，将样品用pH8.0TE稀释后-20冰箱保存备用。2.2AFLP分析8，92.2.1天

7、麻基因组DNA的酶切与连接取参加45l如下的酶切连接混和液：ddH237.85l；10NEB2.5l；se接头(50pll-1)1l；Pst或ER接头5pll-11l；10ATP1l；5l浓度为100200ngl-1天麻基因组DNA；T4DNAlingase5Ul-10.4l；se10Ul-10.5l；Pst或ER(10Ul-1)0.5l。37保温过夜后取5l酶切连接产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。2.2.2预扩增预扩增PR反响体系20l为：ddH210l；10buffer2l；dNTP(2)2l；g2+(20)1.5l；Taq酶(2Ul-1)0.5l；酶切连接产物2l；引物00(50ng

8、l-1)1l；引物P00或E00(50ngl-1)1l。预扩增PR反响程序为：95.05in95.035s56.035s72.01inGTSTEP230yles72.05in4.0保温。反响完毕后取5l预扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。剩余的预扩增产物用TE(pH8.0)溶液稀释20倍后于-20保存，以待选择性扩增用。2.2.3选择性扩增选择性扩增PR反响体系20l为：ddH27l；10buffer2l；dNTP(2)2l；g2+(20)1.5l；Taq酶(2Ul-1)0.5l；稀释20倍的预扩增产物5l；引物(50ngl-1)1l；P或E引物(50ngl-1)1l。选择性扩增PR反响

9、程序为：95.05in95.040s65.0每循环降低0.740s72.01inGTSTEP213yles95.040s56.040s72.01inGTSTEP624yles72.05in4.0保温。选择性扩增产物与7l的LadingBuffer混和，95变性5in，立即转移至冰浴冷却，待用。2.2.4选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳时，先安装好垂直电泳槽然后灌入1TBE电泳液，排除点样孔气泡，2500V恒压预电泳40in。预电泳后将7l变性后的选扩产物上样于点样孔内，2500V恒压电泳至第一条指示剂条带跑至胶板底边时停顿，电泳时间约23h。然后银染显带3。2.3数据统

10、计与分析AFLP电泳图谱用GelPrAnalyzerVersin410分析,只记录那些可识别的、两次扩增结果一致的条带，同一位点有带记为“1,无带记为“0，形成0/1矩阵图输入计算机，采用NTSYSp-2.10s软件的UPGA方法对检测结果进展聚类，计算出天麻各样品的遗传相似度。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1天麻基因组DNA图谱结果见图1。3.2AFLP结果分析利用从30对引物中挑选出的8对AFLP引物对23份野生天麻种质的基因组DNA进展片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果见表2。共扩增出552条谱带100700bp，其中396条具有多态性，占72%，平均每对引物扩增出69条可统计的

11、带，其中50条具有多态性。可见，AFLP检测野生天麻种质资源遗传多样性的效率很高，也充分表达了野生天麻的遗传多样性。结果见图2。表28对AFLP选择性扩增引物产生的条带多态性略3.3遗传间隔 和聚类分析结果见图3。从图3可以看出，23株野生天麻种质两两间的相似系数分布在0.570.85之间，其中21号与23号的相似系数最小，为0.584，说明2种质间的亲缘关系最远。2号与3号、12号与13号、19号与20号的相似系数最大，为0.85，说明这6个种质两两间的亲缘关系最近。以相似系数0.57为标准，23株野生天麻种质可分为A、B两大聚类群，其中红麻和乌麻聚在一起，黄麻和绿麻聚在一起。A聚类群在相似

12、系数0.58附近又分为2个亚类：第1亚类包括18株，在相似系数0.66附近又分为两组，第1组有13株，全部为来自不同产地的乌麻，第2组5株全部为来自不同产地的红麻。说明野生天麻种间变异度比拟校从图3还可以看出多数来源地一样的种质表现出较为亲密的亲缘关系，比方来自遵义地区的1、2、3、号聚在一起，来自德江的19、20号聚在一起等。但也有同一来源地的品种未聚在一起的情况，比方来自遵义的1、2、3、4、5、6号没有完全聚在一起。说明同一品种一样地区的种间变异度比拟大。第2亚类只有1株，为乌麻品种。B聚类群包括4株，该类包含两个品种黄麻和绿麻，其中7号绿麻与10号和11号黄麻先聚在一起，再与21号绿麻

13、聚合；7号和21号同为绿麻，但是并没有聚在一起，可能是因为产地相距较远。4讨论本试验利用AFLP方法分析了23份野生天麻的遗传差异，获得了约72%的多态性位点。邹佳宁等1利用RAPD研究天麻种质的遗传关系，获得70.97%的多态性位点，与我们得到的结果略有差异。这可能是由于AFLP在扩增出丰富的多态性带的同时也扩增出了大量的单态性带，使得其多态性带的百分率并没有明显进步。但平均每对引物所产生的多态性带数69条明显高于前者的7.75条。由此可见，AFLP标记显然是快速、高效的分子标记。此外，从DNA分子程度上来说，遗传多样性越高，说明其遗传背景越复杂，该物种存在的历史越长远。约72%的多态性，说

14、明野生天麻在其遗传进化过程中，基因组DNA发生了丰富的变异。同时也提醒了野生天麻种质资源极其丰富的遗传多样性。一个物种的进化潜力和抵御逆境的才能取决于种内遗传变异的大小，遗传多样性越丰富，对环境变化的适应才能越强，其自然分布范围越广。聚类图中两大群中大局部同一变型、同一来源地的天麻优先聚合，表现出较为亲密的亲缘关系。这与天麻野生种源生态条件与生态习性等综合因素有关。但也有同一来源地的品种未聚在一起的情况，这种现象可能是AFLP方可反映基因组本质的差异所致。在第一大类中，红麻和乌麻先聚在一起，再与不同产地的乌麻聚为一大类，同样第二大类中黄麻和绿麻先聚在一起，再与其它产地的绿麻聚为一大类，这一方面

15、说明野生天麻种间变异度比拟小，红麻和乌麻遗传相似度比拟大，黄麻和绿麻遗传相似度比拟大。另一方面也反映了不同产地的同一品种间变异度比拟大，说明不同的环境因素可能是造成天麻遗传变异的主要因素。此与邹佳宁等对野生和栽培天麻亲缘关系的RAPD分析结果有相似之处，邹佳宁等认为，地理分布和生长环境的差异是导致天麻形成丰富的遗传多态性的一个重要的原因。野生天麻种质在长期的自然选择下积累了丰富的遗传变异，遗传组成异常复杂，有必要结合形态与分子分类对野生天麻种质资源进展更深化的研究，以便为野生天麻种质资源利用提供科学根据。此外，不同生态区野生天麻品种间遗传差异相对较大。在进展天麻杂交育种时，应尽可能选择生态类型

16、差异较大的育种材料，以使杂交后代有更多时机出现理想的性状组合，培育出更多更好的天麻新品种。【参考文献】1邹佳宁,宋聚先,常楚瑞，等.贵州天麻种质资源的RAPD分析J.中药材，2022,299：881.2赵永亮，傅体华，范巧佳，等.野生天麻栽培天麻的RAPD和AFLP标记遗传多态性分析J.安徽农业科学,2022，36(17):7119.3关萍，马丹炜，王贵侠，等.利用ISSR标记对天麻的贵州种群遗传多样性分析J.北京林业大学学报，2022，296：35.4常楚瑞,王晓丽.一种适于AFLP分析的天麻花葶DNA提取方法J.贵阳医学院学报，2022，306：502.5李相陵，王晓玲，刘安发.天麻总DNA提取的研究J.贵阳医学院学报，2022，305：399.6颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南.北京：科学出版社，1998，6:37.7郭宝林,李家实,阎玉凝.中药材DNA分子标记研究的技术问题(1)植物药基因组DNA的提取J.中草药,2000,31(12):951.8Z