微生物制药工艺学(发酵工艺设计与优化)0706课件

1、 微生物制药工艺学发酵过程工艺设计与优化重庆大新药业股份有限公司 研发中心 郭明2007年6月需要解决的四个问题工艺流程设计（种子扩大级数）工艺参数设计（种龄、种量、温度、转速、通气比、pH控制、泡沫控制、补料策略、搅拌与罐体设计等等）染菌的防治工艺参数的优化典型的发酵工艺流程图种子制备种子扩大培养的目的与要求如何确定种子扩大培养级数各级种子的质量标准制定（种龄、菌丝形态、 pH、菌浓等）可能出现的问题及解决措施种子扩大培养的目的与要求 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这

2、些纯种培养物称为种子。 纯种、合适的量、适宜的种龄、健壮是实现代谢产物最经济生产的基础！ 如何确定进罐种子的方式？ 实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法，采用菌丝体接种。孢子的制备： 孢子产生条件：干燥、营养缺乏、成熟期产生 孢子检测：压片法，显微观察 细菌孢子制备：限制碳源，使氮源丰富，培养温度37，时间2天左右，产芽孢杆菌时间约长。 放线菌孢子制备：放线菌的孢子培养一般采用琼脂培养基，培养基中含有一些适合产孢子的

3、营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28C。培养时间为514天； 霉菌孢子的制备：霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528C。培养时间一般为414天液体种子（菌丝体）的制备 好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子（可来自于斜面、冻存管、冻干管）或菌丝体（来自于液氮保存管）接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 试管（冻存管、冷冻管、液氮冻

4、存管等）三角摇瓶振荡培养种子罐 厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管三角瓶卡式罐种子罐摇瓶种子菌丝摇瓶种子菌丝如何确定种子的培养级数种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌丝，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： （1) 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； (2) 所采用发酵罐的容积。细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）二级种子罐（ 27C,1024小时，菌体迅速繁

5、殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，一般三级，甚至采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 确定种子罐级数需注意的问题：种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 种子的质量及其影响因素种子的质量标准：菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； 生理形状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染； 保持稳定的生产能力

6、种子质量检测指标：pH；菌种的数量 培养基灭菌前后磷、糖、氨基氮的含量；菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）；其他参数，如接前抗生素含量、某种酶活力等。影响种子质量的因素：原料质量和培养基：培养条件斜面冷藏时间染菌原材料质量与培养基生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。影响种子质量的因素培养条件：（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。主要影

7、响酶反应和生命运动。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度。2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。（3）pH：主要是H对微生物生命活动的影响。（4）通气量与搅拌： 微生物不同阶段对氧的需求是不同的，通常在种子扩培过程中，前期需氧量大，后期较小。搅拌有利于传质，传氧。但不可过于剧烈。 例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵

8、有利。出发菌种保存时间：斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。如何防治种子培养、移种过程的染菌？无菌室要求：基本功 种子接种过程： 熟练、规范。生产中常出现的问题及解决措施菌种生长速度: 过快或过慢 菌丝结团菌丝粘壁种子质量的控制措施种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次

9、是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。 菌种稳定性的检查无菌（杂菌）检查发酵工艺设计要解决的问题 1.工艺的选择（分批、半连续、连续培养） 2.培养基灭菌方式的选择 3.移种方式的选择 4.发酵工艺参数的选择 温度、搅拌叶设计及搅拌转速、罐压与通气比（溶氧）、pH调节与补料、泡沫控制、染 菌防治等等工艺选择 分批、半连续、连续培养优缺点分批发酵：优点是操作简单、周期短、染菌机会少、生产过程和产品质量容易掌握。缺点是产率低，设备利用率低。补料分批培养与半连续：这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用

10、计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。由于没有物料取出或取出其中的一部分，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会。连续培养：优点是控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学。缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。培养基灭菌方式灭菌的原因：在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响 。举例：如果在谷氨酸发酵过程中混人放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，

11、这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。 灭菌方式： 热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）、化学灭菌、辐射灭菌、过滤除菌等。培养基热灭菌 连消（连续灭菌） 实消（实罐灭菌) 灭菌原则：控制灭菌温度与时间，既达到无菌要求，又使营养成分破坏减少到最低。移种方式从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种 从种子罐接种接种龄与种量种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一

12、般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。 接种量： 基于实验室摇瓶试验结果，判定过小、过大的接种量对发酵指标的影响。 移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积 过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素种子罐到发酵罐为7-15%。但是一般认为大一点好。摇瓶菌丝种子液进入种子罐一般为0.2-1%。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。发酵工艺设计发酵工艺控制参数；发酵的中间控制的项目包括：温度控制、pH控制、泡沫控制、补料控制、溶氧的控制、染菌控制； 工艺执行上表现在： 温度调节； 搅拌浆型式与搅拌转速； 空气流

13、量与罐压调节； pH调节； 补料策略；工艺控制依据：过程菌丝或细胞形态、营养代谢与产物形成等。发酵工艺参数温度： 不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于026 生长，嗜温菌适应于1543 生长，嗜热菌适应于3765生长，嗜高温菌适应于65 以上生长温度的影响（1）产热： 生物热Q生物） 、摩擦热Q搅拌 散热： 蒸发热Q蒸发 、辐射热Q辐射 Q发酵 = Q生物 + Q搅拌 - Q蒸发 - Q辐射 酶学方面：在一定温度范围内，温度升高，反应速率加大，有利于菌体生长和产物积累，但菌体的衰退也加快，菌体对氧的消耗相应加快，而温度升高时，氧的溶解度下降，所以应

14、综合考虑。温度的影响（2）产物方面：温度能影响菌体分泌的产物种类及酶系。用米曲霉制曲时，如温度在低限时，得到蛋白酶，此时-淀粉酶的合成受到抑制。又如用凝结芽孢杆菌合成-淀粉酶时，发酵温度控制在55时，合成的-淀粉酶较耐高温，在90、60min条件下，其活性丧失仅10左右，而发酵温度控制在35时，合成的-淀粉酶在相同条件下丧失90。菌体特性方面：同种菌体在生长和产物积累阶段所要求的温度往往有差别，多数情况下是最适生长温度比产物积累的最适温度要略高些。搅拌与通气 原则：高溶氧、低剪切溶氧浓度的变化溶氧浓度的控制 需氧因素：菌体浓度、遗传因素、菌龄、营养成分与浓度、有害物质的积累、培养条件。 供氧因

15、素： KLa与初始氧浓度 影响KLa因素：提高搅拌，增加通气量调节kla的效果显著。CL临界氧溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCrQO2CLCCrCCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。一般对于微生物： CCr: 115%饱和浓度考虑氧传递与剪切，追求高溶氧、低剪切。传统型式：箭叶、弯叶、直叶新型：半圆叶、螺旋桨叶，增加轴向流。搅拌发酵工艺参数pHpH值对菌体生长和代谢产物形成的影响 影响微生物活动环境的离子强度、细胞膜的透性及膜上的带电性和氧化-还原电位、酶活性。如黑曲霉在酸性（pH23）时，进行柠檬酸发酵，而在接近中性时，则进行草酸发酵。发酵过程中pH值的调节及控

16、制 调整培养基组分 在发酵过程中进行控制，根据发酵液pH值的变化，进行相应补料控制发酵工艺参数补料： 补料的意义、内容、原则 意义：补充菌体营养，延长发酵期（推迟自溶期），提高发酵产量； 内容：补充C源、N源、无机盐、诱导酶的底物； 原则：根据菌体生长代谢规律；生产需要；补料操作 时间：为达到生产目的，在需要时加入； 方式：以不引起发酵液成分剧烈波动为前提； 补量：加入与消耗平衡；前体补加-四两拨千斤抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素去甲基链霉素四环素去甲基金霉素头孢菌素C利福霉素甘露糖链霉素链霉素金霉素金霉素头孢霉素N其他利福霉素甘露聚糖乙硫氨酸溴化物、硫脲硫胺化合物L-蛋氨酸巴比妥药物菌丝形态

17、表征生长与代谢菌丝生长过程不同紧密程度的菌团松散的菌丝由于传质阻力小，底物供应充分，能快速生长，大量分枝，它们的代谢主要支持生长，属于初级代谢，其利用速率要高于底物限制下的情况证据：菌丝发散情况下CER、OUR要远高于一般批次不同转速对前期菌丝生长影响18h 600rpm18h 300 rpm菌丝自溶在菌丝即将自溶时，结束发酵在发酵过程中，严格防止菌丝自溶泡沫影响与控制泡沫的产生、性质及变化 泡沫实际上是气溶胶构成的胶体系统，其分散相是空气和代谢气，连续相是发酵液，泡沫间隔着一层液膜而被彼此分开不相连通。泡沫对发酵的影响 减少发酵的有效容积，若不加控制，过多的泡沫通过 排气管溢 出，造成发酵液

18、流失； 过多的泡沫可能从罐顶的轴封渗出罐外，这就增加了染菌的机会； 使部分菌体粘附在罐盖或罐壁上，而失去作用； 泡沫严重时，影响通气搅拌的正常进行，妨碍代谢气的排出，对菌体呼吸造成影响，甚至使菌体代谢异常，影响生产率。泡沫的控制：化学消泡、机械消泡。化学消泡剂消泡剂选用依据： 表面活性剂，具有较低的表面张力（内聚力弱），消泡效果明显。 对气-液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡； 无毒害性，且不影响发酵菌体； 不干扰各种测量仪表的使用； 在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能； 来源方便，使用成本低；常用的一些消泡剂：天然油脂；高碳醇、脂肪酸和酯类；聚醚类；硅酮类；应用：在消泡剂的使用时

19、主要是让其有足够的分散性能，除用机械方式协助其扩散外，还用载体以助其分散，具体使用有以下几种形式： 消泡剂 + 载体； 复合消泡剂； 消泡剂 + 乳化剂染菌控制日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94无菌空气处理系统空压机储罐二级冷却加热器空气过滤噬菌体污染防治是微

20、生物制药过程的重要工作之一电动机pH检测及控制装置培养液无菌空气排气口冷却水出口冷却水进口搅拌器加料口放料口发酵罐示意图发酵工艺参数的优化发酵工艺优化目的提高产量减少副产物产生节能发酵工艺优化研究手段代表性的发酵生产工艺介绍从自然界分离的菌种产 品基因工程诱变育种诱变育种生产用菌种扩大培养原 料微生物菌体代谢产物分离提纯发酵罐发酵条件控制接种培养基配置灭菌通过参数优化工艺，优化后的工艺通过参数验证参数(变量)分类直接参数: 物理参数，如温度、通气流量、搅拌转速、 化学参数,如DO、pH、排气02、CO2 生物量参数 ，菌量，OD 间接参数: 由一些直接参数计标得到的各种反映过程特性 的参数。如

21、OUR,CER,RQ手工参数: 取样后实验室手工测量参数，离线输入。工艺优化的手段基于发酵过程各参数和代谢物生化合成途径进行相关分析，找到影响代谢物积累的敏感因素，进行多尺度干预。发酵过程参数检测的多样性、准确性是实现工艺优化的基础。工艺优化一般通过培养基改进、温度、pH、搅拌、通风、补料等方式实现。试验多批次，结论更可靠。补糖与pH相关图发酵工艺优化实例红霉素发酵过程优化研究 中国工程科学2001年，8期DO-发酵液中溶解氧浓度、OUR-菌体代谢耗氧速率、CER-二氧化碳释放速率、RQ-呼吸商-代谢途径、KLa-生物反应器中氧传递速率、pH酸碱度、菌体浓度、等40多个参数9-25小时之间 RQ（CER/OUR）呈低谷状 必需限制补葡萄糖生物相关：OUR、 CER、 RQ值相关生物相关：加入葡萄糖对RQ的影响还原性较高的基质作碳