血管内皮细胞生长因子和血管发生素

1、血管内皮细胞生长因子和血管发生素【关键词】斑马鱼；,血管发生素摘要：目的讨论血管内皮细胞生长因子和血管发生素1及其受体在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达，为构建药物挑选的在体模型提供根据。方法采用多聚酶链式反响，扩增了长约280bp的斑马鱼血管发生素1DNA局部序列，作为探针，以原位杂交法测定了血管内皮细胞生长因子和血管发生素1及其相应受体flk1和Tie2的表达。结果从受精卵胚胎发育第12小时可见血管内皮细胞生长因子和血管发生素1及其相应受体flk1和Tie2的表达；在受精卵胚胎发育的第16小时，血管内皮细胞生长因子和血管发生素1主要在头部和尾部胚芽表达；第24小时在眼球、视窝、中脑、后脑的腹

2、前侧和肌节中表达，Tie2和Flk1主要在肌间背部动脉血管、躯干新生血管芽和轴向静脉中表达。结论血管内皮细胞生长因子和血管发生素-1及其受体在斑马鱼胚胎发育早期的血管发生过程中可能互相作用，并协调血管发生过程。斑马鱼是研究胚胎发育早期微血管发生和血管发生的极佳动物模型，可用于促血管发生或抑制血管发生药物筛眩关键词：斑马鱼；血管发生素1；血管内皮生长因子；受体ExpressinsfAngipietin1andItsReeptrsDuringEarlyDevelpentinZebrafishAbstrat：bjetiveTinvestigatetheexpressinfvasularendthel

3、ialgrthfatr(VEGF)andangipietin1(Ang1),andthEirreeptrsFlk1andTie2duringangigenesisandvasulgenesisinearlyebrydevelpentfzebrafish.ethdsUsinghlgy-basedplyerasehainreatin,a280bpfpartialDNAfzebrafish(zfAng1)asislated.TheexpressinsfAng1,Tie2,VEGFandFlk1inzebrafishereexainedduringupt24hebrynidevelpentbyhleu

4、ntinsituhybridizatin.ResultsThereerendetetableexpressinsfthesegenesupt10hpstfertilizatin.Hever,thereeredetetableexpressinsfthesegenesat12h.At16h,Ang1andTie2ereexpressedainlyinheadandtailbud.At24h,Ang1asexpressedainlyinthelens,ptiup,esenephaln,ventralpartfhindbrain,andytesinthesites,hilezfTie2asainly

5、expressedinintersitivesselsinludingdrsalartaandaxialvEIns,andsprutingvesselsfrthedrsalartainthetrunk.VEGFasexpressedainlyinthelens,ptiup,esenephalnandytesinthesites,hilezfFlk1asainlyexpressedinintersitivesselsinludingdrsalartaandaxialveins,andsprutingvesselsfrthedrsalartainthetrunk.nlusinAng1,VEGF,T

6、ie2andFlk1,ayatperativelyandinterativelyfrvasulardevelpentinzebrafishduringearlydevelpent.Presentresultsalssuggestedthatzebrafishasaqualitydelfrstudynvasulgenesisandangigenesisduringebrynidevelpentandsreeningfrangigenienhanerrinhibitrs.Keyrds：Zebrafish;Angipietin1;Vasularendthelialgrthfatr;Reeptr斑马鱼

7、(zebrafish,Danireri)具有世代周期短23个月，雌性个体可产大量卵，形体较小，易于在有限的空间内饲育，早期胚胎发育过程血管发生过程透明便于直接观察1。斑马鱼还具有和其他脊椎动物相近的基因构造和调节形式2。因此,利用斑马鱼发育过程中的这些优点将有助于在体研究血管发生和微血管发生3。目前,血管内皮细胞生长因子(vasularendthelialgrthfatr,VEGF)及其受体Flt-1在斑马鱼中的表达情况已经相比照拟清楚4，5。但对于血管发生素1(angipietin1,Ang1)及其受体Tie2在斑马鱼发育过程中的表达尚不清楚。为此,我们检测了Ang1及其受体Tie2在斑马鱼

8、早期胚胎发育过程中的表达情况，以期为建立促血管发生或抑制血管发生的药物挑选的动物在体模型奠定基矗1材料与方法1.1试剂除特殊标记的试剂外的其他试剂均购自Siga公司。1.2斑马鱼Ang1(zebrafishAng1，zfAng1)DNA局部序列的别离从受精卵发育24h的胚胎lZAPDNA文库(Stratagene,USA)中以PR和特定引物扩增出一段斑马鱼zfAng1DNA局部序列，引物根据包括人、小鼠和牛在内的Ang1蛋白的羧基端构造域纤维蛋白样构造域(fibringenlikedain)的氨基酸序列设计。所用的引物：5TAAA(A/G)AA(A/G)GG(A/G)TT(/T)GG(A/G)

9、AAT(AGT)3，与人的Ang1蛋白的第344到第352位氨基酸序列YKKGFGNP相对应;5(TG)A(/T)G(A/G)T(A/G)AAAA(/T)(A/G)3，与人的Ang1蛋白的第445到第452位氨基酸序列GGFDA相对应。扩增条件：蛋白的第445到第452位氨基酸序列GGFDA相对应。扩增条件：94预变性4in，9410s，6030s，68120s，进展40个循环。扩增获得约270个碱基对的DNA片段，应用Apliyle测序，扩增的DNA克隆至PRBlunt载体上。1.3动物斑马鱼购自arlinaBilgialSupplypany饲养于光照14h/10h黑暗周期，水温28.5的鱼

10、缸中。雌雄斑马鱼的投放比例为32。在给予光照后10in内以虹吸管搜集受精卵，放置28.5盛有E3培养液的平皿中孵育。1.4hleunt原位杂交用所克隆到的zfAng1DNA作为探针，采用PR从斑马鱼受精卵发育24h时相的ZAPDNA文库中克隆得到zfVEGF的全长序列的探针。zfTie2探针由美国杜克大学KevinPeters博士惠赠，zfFlk1的探针由美国卡罗林那大学DidierStainier博士惠赠。斑马鱼的胚胎固定于焦碳酸二乙酯处理的磷酸盐缓冲液配成的4%多聚甲醛，蛋白酶K酶解，用2g/L的甘氨酸清洗2次，再次固定和清洗，样本在55进展预杂交和杂交，未结合的探针用RNaseA(20g

11、/l)加以去除。样品用羊血清封闭后,在碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体孵育后,参加底物BIP/NBT进展显色。为进展组织学检测,标本再次用4%PFA固定、脱水、包埋在JB4包埋剂中，用irte(Zeiss)低温切片机制成1厚切片。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1zfAng1的DNA和氨基酸序列用同源PR法扩增得到了约280bp的zfAng1DNA片断，以此片断的DNA可编码得到含有90个氨基酸残基的zfAng1，将所得到的zfAng1DNA片断和人、小鼠及牛的血管生成素基因中编码纤维蛋白原构造域的核酸序列进展的多重比拟具有54%57%的同源性，由所获得的zfAng1DNA片断预测可能编码得到的氨

12、基酸序列和人、小鼠及牛的血管生成素氨基酸序列比拟，分别具有41%45%的同源性。结果见图1。一样的序列用阴影表示2.2斑马鱼的Ang1,Tie2,VEGF和Flk1的表达形式应用hleunt原位杂交法对zfAng1和zfTie2在斑马鱼受精卵胚胎发育至24h的表达进展了测定。结果说明：到斑马鱼受精卵胚胎发育10h为止，未检测到zfAng1和zfTie2的表达；在胚胎发育第12小时可检测到zfAng1在斑马鱼胚胎头部背侧和zfTie2在头部腹侧的表达；在第16小时zfAng1主要表达于前脑、后脑和尾芽，而zfTie2主要表达于前脑、中脑前部和尾芽的腹前侧；至第24小时，zfAng1主要表达于眼球

13、、视杯、中脑、后脑腹侧和肌节中的肌肉局部，而zfTie2那么极少在头部内皮侧表达，主要在包括背部动脉和腹侧静脉及躯体背动脉的芽生血管等肌间血管中表达。结果见图2。在斑马鱼受精卵胚胎发育至10h未能检测到zfVEGF及其受体Flk1的转录产物，而在第12小时可观测到zfVEGF及其受体Flk1的转录产物的表达，这和已有的研究报道相符57。至第24小时,zfVEGF主要表达于眼球、视杯、中脑和肌节,而zfFlk1那么主要表达于包括背部动脉、轴向静脉以及躯干背动脉的芽生局部在内的肌间血管。结果见图3。3讨论本研究说明Ang1、VEGF及其受体Tie2和Flk1在斑马鱼早期胚胎发育过程中变化显著。这些

14、基因不仅在血管部位表达，而且在包括眼睛在内的神经系统中表达，说明这些基因除了参与斑马鱼的血管发生过程，在斑马鱼的神经系统的发育过程中也扮演着重要的角色。zfTie2和zfFlk1在内皮细胞有着很强特异性表达。已有研究报道证实可在斑马鱼胚胎发育18h检测到zfTie2和zfFlk1的表达，在斑马鱼受精卵发育的第30小时，可在所有内皮细胞中检测到zfTie2和zfFlk1的表达，在斑马鱼胚胎的头部、心脏、躯干和尾部的血管内皮细胞都检测到zfTie2和zfFlk1的表达8。我们的研究结果说明，在斑马鱼后续胚胎发育过程中躯干背主动脉内皮细胞芽生出也可检测到zfTie2和zfFlk1的表达。因此，同哺乳

15、动物的胚胎发育过程中一样,zfAng1和zfVEGF及其受体zfTie2与zfFlk1可能在斑马鱼出生前的血管发育过程中互相协同、互相作用。本研究结果还说明,zfAng1及其受体Tie2可作为研究早期胚胎发育过程中血管发生的良好标志物，斑马鱼也是促进或抑制血管发生药物挑选的极佳的动物模型。参考文献：1StainierDYR,Fishan.ThezebrafishasadeltstudyardivasulardevelpentJ.Trendsardivased,1994，4：207.2DddA,urtisP,illiasL,etal.Zebrafish:bridgingthegapbeteend

16、evelpentanddiseaseJ.HulGenet,2000，9：2443.3SerbedzijaGN,FlynnEandillettE.Zebrafishangigenesis:AnedelfrdrugsreeningJ.Angigenesis,2000,3:353.4BrEierG,AlbrehtU,SterrerS.etal.ExpressinfvasularendthelialgrthfatrduringebryniangigenesisandendthelialelldifferentiatinJ.Develpent,1992,114:521.5LiangD,XuX,hinAJ,etal.lningandharaterizatinfvasularendthelialgrthfatr(VEGF)frzebrafish,DanireriJ.BiphiiaBiphysiaAta,1998,1397:14.6Lia,BisgrveB,SayerH,etal.Thezebrafishgenelheatsupstreafaflk-1hlguetregulateendtheli