总大肠菌群的检验

1、环境工程微生物学实验报告实验名称：总大肠菌群的检验专 业：环境科学班 级：环科111学 号：1108100069学生姓名：余永浩指导教师：钱晓莉实验日期:_2013415-2013419一、实验名称总大肠菌群的检验二、实验目的（1）了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性，学会总大肠 菌群的检验方法。（2）通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。三、实验原理人的肠道中主要有3大类细菌：大肠菌群（G-菌）：肠球菌 （G+菌）：产气荚膜杆菌（G+菌）。由于大肠菌群的数量最大，在体 外存活时间和肠道致病菌相近，且检验方法比较简单，所以被定为检 验肠道致病菌的指示菌。总大肠菌群包括肠杆菌科中的埃希氏菌

2、属（模式种：大肠埃希氏 菌）、柠檬酸细菌属、克雷氏菌属及肠杆菌属。这4种菌属都是兼性 厌氧、无芽孢的革兰氏阴性杆菌（G-菌），他们的生化反应特点已在 微生物的生理章节中介绍。大肠菌群的检测方法主要有多管发酵和滤膜法。前者被称为水的 标准分析法，即将一定量的样品接种到乳糖发酵管，根据发酵反应的 结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查处大肠菌群的近似值。 后者是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但至局限于饮用 水或较为干净的水，目前在一些大城市的水厂采用此法。四、实验仪器及其材料（一）器皿显微镜、锥形瓶（500ml） 1个、试管（18mmX180mm） 6或7支、 大试管（容积150ml

3、）2支、移液管1ml2支及10ml 一支、培养皿10 套、接种环、试管架一个（二）试剂、材料（1）化学药品：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸 钠、牛肉膏、氯化钠、质量浓度16g/L的溴甲酚紫乙醇容溶 液、质量浓度50g/L的碱性品红溶液、质量浓度20g/L的伊 红水溶液、质量浓度5g/L的亚甲蓝水溶液（2）采集于贵大新校区的生活污水（3）革兰氏染色液一套：草酸铉结晶紫、革兰氏碘液、体积分数 为95%的乙醇、番红染液。（4）其他：100g/L的氢氧化钠、体积分数10%的HCl、pH试纸五、实验步骤: （一）配制培养基：（4月15日）乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵的复发酵使用）配方：蛋白胨

4、10克、牛肉膏3克、乳糖5克、氯化钠5克、溴甲酚 紫乙醇溶液（16g/L） 1mL、蒸馏水1000 mL制备：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为 7.27.4,再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于 装有倒管的试管中，每管10mL, 68.95kPa （115C, 10lb）高压灭菌 20min，取出后置于阴冷出备用。三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵的初复发酵使用）按照乳糖蛋白胨培养基的配方和制法，除蒸馏水外，其他成分量 浓缩三倍。品红亚硫酸钠培养基（即远藤氏培养基）该培养基供多管发酵的平板画线使用。（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二

5、钾3.5g、琼脂20g、 蒸馏水1000mL、无水硫酸钠5g、50g/L的品红乙醇溶液20mL。（2）制备：先将琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷 酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，补足失水到1000mL，调 整pH为7.2-7.4,趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖， 混匀后定量分装于锥形瓶中，包装后灭菌。伊红-亚甲蓝培养基（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂 20g30g、蒸馏水1000ml、伊红水溶液（20g/L）20mL、亚甲蓝水 溶液（5g/L）13mL。（2）制备：与品红亚硫酸钠的制备过程相同，琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和

6、蛋白胨，混匀，补足 失水到1000mL调整pH为7.2-7.4趁热用脱脂棉过滤，再加 入乳糖，混匀后装于锥形瓶中，灭菌。（二）测定步骤：（4月17日）多管发酵法（1）按要求配制乳糖蛋白胨培养基、三陪浓缩乳糖蛋白胨培养基、 品红亚硫酸钠培养基、伊红-亚甲蓝培养基。（2）初发酵试验：在2支各装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 的大发酵管中，以无菌操作各加入水样100mL。在10支各装有5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10mL水 样，混匀后置于37恒温箱中培养24h,观察其产酸产气的情况。（3）确定性试验：用平板划线分离，将经培养24h后产酸的发酵管 取出，无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基平 板上划线分离，置于37恒温箱内培养1824h，观察菌落特征。（4）复发酵实验：无菌操作，用接种环挑取具有培养基平板上菌落的特征的菌落于装有 10mL普通浓度的发酵培养基内，每管可接种同一平板上的13个典 型菌落的细菌，于37r恒温箱内培养24h。观察。六、实验结果及其分析讨论：（1）在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：a:紫红色，具有金属光泽的菌落；b：深红色，不带或者略带金属光泽的菌落；c：淡红色，中心色较深的菌落。（2）在伊红一亚甲蓝培养基平板上的菌落特