食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 标准文本 （食品安全国家标准）

1、GB/T 2014 PAGE 3 PAGE 1食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定1 范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2（以下简称AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2）的测定方法。本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品和特殊膳食用食品中AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的测定。本标准第二法为高效液相色谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品和特殊膳食用食品中AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的测定。

2、本标准第三法为薄层色谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品和特殊膳食用食品中AFT B1的测定。第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法2 原理试样中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液用含1 %Triton X -100（或吐温-20）的PBS溶液稀释后，经免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。3 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱

3、纯。3.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.3 醋酸铵（CH3COONH4）。3.1.4 氯化钠（NaCl）。3.1.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。3.1.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。3.1.7 氯化钾（KCl）。3.1.8 浓盐酸（HCl）。3.1.9 Triton X - 100（C14H22O（C2H4O）n）（或吐温-20，C58H114O26）。3.2 试剂配制3.2.1 5 mmol/L醋酸铵水溶液：称取0.39 g醋酸铵固体，用水溶解后稀释至1000 mL。3.2.2 乙腈-水溶液（84+16）：取840 mL乙腈加入160 mL水。3.2.3 甲醇-水溶液（70

4、+30）：取700mL甲醇加入300mL水。3.2.4 乙腈-水溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL水。3.2.5 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。3.2.6 10 %盐酸溶液：取浓盐酸1mL，用纯水稀释至10 mL。3.2.7 磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00 g氯化钠，1.20 g磷酸氢二钠（或2.92 g十二水磷酸氢二钠），0.20 g磷酸二氢钾，0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH值至7.4，加水稀释至1000 mL。3.2.8 1 % Triton X 100（或吐温-20）的PBS：取10 m

5、L Triton X- 100（或吐温-20），用PBS稀释至1000 mL。3.3 标准品3.3.1 AFT B1标准品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8）：纯度98 %。3.3.2 AFT B2标准品（C17H14O6 ，CAS：7220-81-7）：纯度98 %。3.3.3 AFT G1标准品（C17H12O7 ，CAS：1165-39-5）：纯度98 %。3.3.4 AFT G2标准品（C17H14O7 ，CAS：7241-98-7）：纯度98 %。3.3.5 同位素内标13C17-AFT B1（C17H12O6 ，CAS：1217449-45-0）：纯度98 %。3.3

6、.6 同位素内标13C17-AFT B2（C17H14O6 ，CAS：1217470-98-8）：纯度98 %。3.3.7 同位素内标13C17-AFT G1（C17H12O7 ，CAS：1217444-07-9）：纯度98 %。3.3.8 同位素内标13C17-AFT G2：（C17H14O7 ，CAS：1217462-49-7）：纯度98 %。注：在检测中可以只使用13C17-AFT B1一种同位素内标，但需要对被测定试样基质进行加标实验，评估和确定13C17-AFT B1与其他几种被测黄曲霉毒素在同一基质中的离子化效率。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备溶液（10 g/mL）：分别

7、称取AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2 1 mg（精确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液浓度约为10 g/mL。溶液转移至试剂瓶中后，在-20下避光保存，备用。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。3.4.2 混合标准储备溶液（1.0 g/mL）：分别准确吸取10 g/mLAFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2标准储备液各1.00mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到1.0 g/mL的混合标准液。此溶液密封后避光-20 保存，三个月有效。3.4.3 混合标准工作液（100 ng/mL）：准确移取混合标准储备溶液（

8、1.0 g/mL）1.00mL至10 mL容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光-20 下保存，三个月有效。3.4.4 混合同位素内标工作液（100 ng/mL）：准确移取0.5 g/mL 13C17- AFT B1、13C17- AFT B2、13C17- AFT G1和13C17- AFT G2各2.00 mL，用乙腈定容至10 mL。在-20 下避光保存，备用。3.4.5 标准系列工作溶液：准确移取混合标准工作液（3.3.11）10 L、50 L、100 L、200 L、500 L、800 L、1000 L至10 mL容量瓶中，加入20 L 100 ng/mL的同位素内标工作液（3.3.1

9、2），用初始流动相定容至刻度，配制浓度点为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的系列标准溶液。 4 仪器和设备4.1 匀浆机。4.2 高速粉碎机。4.3 组织捣碎机。4.4 超声波震荡器。4.5 天平：感量0.01 g和0.00001 g。4.6 涡旋混合器。4.7 高速均质器：转速6，500-24，000 转/min。4.8 离心机：转速6000 转/min。4.9 真空泵。4.10 氮吹仪。4.11 液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。4.12 液相色谱柱： C18柱（柱长100 mm，柱内径2.1 mm；填料粒径1.7 m），或相当者。4.13 50 m

10、L具塞PVC离心管。4.14 移液管：1.0 mL，5.0 mL，20.0 mL。4.15 50 mL一次性注射器（使用注射器筒部分）。4.16 免疫亲和柱：柱容量 300 ng，其中AFT G2的交叉反应率 80 %。（柱容量验证方法参见附录A.2）注：对于每个批次的亲和柱在使用前需质量验证。4.17 多功能柱或功能相当的固相萃取柱：对复杂基质样品测定时使用。4.18 带刻度的磨口玻璃试管：10 mL。4.19 微孔滤头：带0.22 m微孔滤膜。4.20 筛网：20目。5 分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同，应该按照供应商所提供的操作说明书要求进

11、行操作。5.1 样品制备5.1.1 液体样品（植物油、酱油、醋等）采样量需大于1 kg，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，任意抽取其中的100 g样品进行检测。5.1.2 固体样品（谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿米粉等）采样量需大于1 kg，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于20目，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。5.1.3 半固体（腐乳、豆豉等）采样量需大于1 kg，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），用组织捣碎机捣碎混匀后，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。5

12、.2 样品提取5.2.1 液体样品5.2.1.1 植物油脂在50 mL离心管中称取5 g经混合均匀的试样（精确至0.01 g），加入100 L同位素内标工作液（3.3.11）振荡混合后静置30min。加入20 mL乙腈-水溶液（3.3.2）或甲醇-水溶液提取（3.3.3），涡旋混匀，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/min 下离心10分钟，取上清液备用。5.2.1.2 酱油、醋在50 mL离心管中称取5 g经混合均匀的试样（精确至0.01 g），加入100 L同位素内标工作液振荡混合后静置30min。用乙腈或甲醇定容至25 mL（精确至0.1 mL），涡旋混匀，置于超声波震荡器中

13、震荡20分钟，在6000 转/分下离心10分钟，取上清液备用。5.2.2 固体样品5.2.2.1 一般固体样品在50 mL离心管中称取5 g已磨细、过20目圆孔筛混匀的试样（精确至0.01g），加入100 L同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0 mL乙腈-水溶液（3.3.2）或甲醇-水溶液，涡旋混匀，用均质器均质3分钟，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/分下离心10分钟，取上清液备用。5.2.2.2 婴幼儿配方米粉 在50 mL离心管中称取5 g已磨细、过20目圆孔筛混匀的试样（精确至0.01g），加入100 L同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20

14、.0 mL乙腈-水溶液（3.3.4）或甲醇-水溶液，涡旋混匀，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/min 下离心10分钟，取上清液备用。5.2.3 半固体样品在50 mL离心管中称取5 g经匀浆后的试样（精确至0.01g），加入100 L同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液（3.3.2）或甲醇-水溶液，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/分下离心10分钟，取上清液备用。5.3 净化5.3.1 免疫亲和柱净化5.3.1.1 上样液的准备准确移取4 mL上清液，46 mL 1 %Trition X -100（或吐温-20）的PBS（使用甲醇

15、-水溶液提取时可减半加入），混匀。5.3.1.2 免疫亲和柱的准备将50 mL注射器筒与亲和柱的顶部相连。5.3.1.3 试样的净化免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1-3 mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入10 mL 水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置10 mL刻度试管，取下50 mL的注射器筒，加入21 mL甲醇洗脱亲和柱，控制1-3 mL/min的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，继续用真空泵抽干亲和柱。在50 下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0

16、mL初始流动相，涡旋30 s溶解残留物，0.22 m滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。注：全自动（在线）或半自动（离线）的固相萃取仪器可优化操作参数后对批量样品检测使用.5.3.2 多功能柱和免疫亲和柱同时使用（对花椒、胡椒和辣椒等复杂基质）5.3.2.1 多功能柱净化移取8 mL上清液，按多功能柱操作说明进行净化，收集全部净化液。5.3.2.2 免疫亲和柱净化 用刻度移液管准确吸取上述净化液4 mL，加入46 mL 1 %Trition X -100（或吐温-20）的PBS（使用甲醇-水溶液提取时可减半加入），混匀。按5.3.1.2和5.3.1.3处理。5.4 液相色谱参考条件流动相：A

17、相：5mmol/L醋酸铵水溶液（3.3.1）；B相：乙腈-甲醇溶液（3.3.5）。梯度洗脱：32 % B（0-0.5 min），45 % B（3-4 min），100 % B（4.2-4.8 min），32 % B（5 min）。流 速：0.3 mL/min柱 温：40 。进样体积：10 L。5.5 质谱参考条件检测方式：多离子反应监测（MRM）。离子源控制条件：参见附录A.3中的表A.3-1。离子选择参数参见附录A.3中的表A.3-2。子离子扫描图参见附录A.4中的图A.4-1至图A.4-8。液相色谱-质谱图见附录A.4中的图A.4-9。5.6 定性试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准

18、色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5 之内。待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N 3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N 10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表1规定的范围。表1 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50 % 20 %至50 % 10 %至20 % 10 %允许相对偏差 20 % 25 % 30 % 50 %各检测目标化合物以保留时间和两对离子的（特征离子对/定

19、量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20 %），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。5.7 定量测定在5.4、5.5项液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件下，将标准系列溶液（3.3.12）由低到高浓度进样检测，以AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。取5.3项下处理得到的待测溶液进样，内标法计算待测液

20、中目标物质的质量浓度，按6项计算样品中待测物的含量。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量重新测定。5.8 空白试验不称取试样，按5.2和5.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6 结果计算 按式（1）计算AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的残留量。 （1）式中：X试样中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的含量，单位为微克每千克，gkg-1；A根据试样中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的色谱峰与对应内标色谱峰的峰面积关系，经计算所得的浓度，单位为纳克每毫升，ngmL-1；V1试样提取

21、液体积（植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积；酱油、醋按定容总体积），单位毫升，mL；V2用于过免疫亲和柱的分取体积，单位毫升，mL；V3样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升，mL；m试样的称样量，单位克，g；以重复性条件下获得的两次独立测XX果的算术平均值表示。计算结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测XX果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8 其他本方法的检出限：AFT B1：0.03 g/kg、AFT B2：0.03 g/kg、AFT G1：0.03 g/kg、AFT G2：0.03 g/kg。本方法的定量限：AFT B1：0.1 g/kg、AFT B2：0

22、.1 g/kg、AFT G1：0.1 g/kg、AFT G2：0.1 g/kg。第二法 高效液相色谱法9 多功能柱净化TFA柱前衍生法9.1 原理试样中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液经多功能柱净化去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质，净化液用三氟乙酸柱前衍生，液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。9.2 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。9.2.1 试剂9.2.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。9.2.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。9.2.1.3 正己烷（C6H1

23、4）：色谱纯。9.2.1.4 三氟乙酸（CF3COOH）。9.2.1.5 氮气（N2）：纯度 99.9 %。9.2.2 试剂配制9.2.2.1 乙腈-水溶液（84+16）：取840 mL乙腈加入160 mL水。9.2.2.2 甲醇-水溶液（70+30）：取700 mL甲醇加入300 mL水。9.2.2.3 乙腈-水溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL水。9.2.2.4 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。9.2.3 标准品9.2.3.1 AFT B1标准品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8）：纯度98 %。9.2.3.2 AFT

24、 B2标准品（C17H14O6 ，CAS：7220-81-7）：纯度98 %。9.2.3.3 AFT G1标准品（C17H12O7 ，CAS：1165-39-5）：纯度98 %。9.2.3.4 AFT G2标准品（C17H14O7 ，CAS：7241-98-7）：纯度98 %。9.2.4 标准溶液配制9.2.4.1 标准储备溶液（10 g/mL）：分别称取AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2 1 mg（精确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液浓度约为10 g/mL。溶液转移至试剂瓶中后，在-20下避光保存，备用。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1

25、）。9.2.4.2 混合标准储备溶液（1.0 g/mL）：分别准确吸取10 g/mLAFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2标准储备液各1.00mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到1.0 g/mL的混合标准液。此溶液密封后避光-20 保存，三个月有效。9.2.4.3 混合标准工作液（AFT B1和AFT G1：100 ng/mL，AFT B2和AFT G2：30 ng/mL）：准确移取AFT B1和AFT G1标准储备溶液各1 mL，AFT B2和AFT G2标准储备溶液各300 L至10 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光4 下保存，三个月内有效。9.2.4.4

26、 标准系列工作溶液：分别准确移取混合标准工作液（9.2.4.3）10 L、50 L、200 L、500 L、1000 L、2000 L、4000 L至10 mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度（含AFT B1和AFT G1浓度为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL，AFT B2和AFT G2浓度为0.03、0.15、0.6、1.5、3.0、6.0、12 ng/mL的系列标准溶液）。9.3 仪器和设备9.3.1 匀浆机。9.3.2 高速粉碎机。9.3.3 组织捣碎机。9.3.4 超声波震荡器9.3.5 天平：感量0.01 g和0.00001 g。9.3.6 涡

27、旋混合器。9.3.7 高速均质器：转速6，50024，000 转/min。9.3.8 离心机：转速 6000 转/min。9.3.9 氮吹仪。9.3.10 液相色谱仪：配荧光检测器。9.3.11 色谱分离柱：C18柱（柱长150 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径5.0 m），或相当者。9.3.12 50 mL具塞PVC离心管。9.3.13 定量移液管：1.0，5.0 mL，20.0mL。9.3.14 多功能柱，或相当者。9.3.15 带刻度的磨口玻璃试管：10 mL。9.3.16 一次性微孔滤头：带0.22 m微孔滤膜。9.3.17 筛网：20目。9.4 分析步骤9.4.1 样品制备9.4.

28、1.1 液体样品（植物油、酱油、醋等）采样量需大于1 kg，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3包装（同一批次或号），将所有液体在一个容器中，用匀浆机（9.3.1）混匀后，取其中任意的100 g样品进行检测。9.4.1.2 固体样品（谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿米粉等）采样量需大于1 kg，用高速粉碎机（9.3.2）将其粉碎（粒径小于20目），混合均匀后取样品100 g用于检测。9.4.1.3 半固体（腐乳、豆豉等）采样量需大于1 kg，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3包装（同一批次或号），在捣碎机（9.3.3）中捣碎混匀后，取样品100 g用于检测。9.4.2 样品提取9.4.2.1

29、 液体样品9.4.2.1.1 植物油脂在50 mL离心管中称取5 g经混合均匀的试样（精确至0.01 g），加入20 mL乙腈-水溶液（9.2.2.1）或甲醇-水溶液提取（9.2.2.2），涡旋混匀，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/min 下离心10分钟，取上清液备用。9.4.2.1.2 酱油、醋在50 mL离心管中称取5 g经混合均匀的试样（精确至0.01 g），用乙腈（9.2.1.1）或甲醇（9.2.1.2）定容至25 mL（精确至0.1 mL），涡旋混匀，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/分下离心10分钟，取上清液备用。9.4.2.2 固体样品9.4.2.2

30、.1 一般固体样品在50 mL离心管中称取5 g已磨细、过20目圆孔筛混匀的试样（精确至0.01g），加入20.0 mL乙腈-水溶液（9.2.2.1）或甲醇-水溶液，涡旋混匀，用均质器均质3分钟，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/分下离心10分钟，取上清液备用。9.4.2.2.2 婴幼儿配方米粉 在50 mL离心管中称取5 g已磨细、过20目圆孔筛混匀的试样（精确至0.01g），加入20.0 mL乙腈-水溶液（9.2.2.3）或甲醇-水溶液，涡旋混匀，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/min 下离心10分钟，取上清液备用。9.4.2.2.3 半固体样品在50 mL离

31、心管中称取5 g经匀浆后的试样（精确至0.01g），加入20.0mL乙腈-水溶液（9.2.2.1）或甲醇-水溶液，置于超声波震荡器中震荡20分钟，在6000 转/分下离心10分钟，取上清液备用。9.4.3 多功能柱净化移取8 mL上清液，按多功能净化柱操作说明进行净化，收集全部净化液。9.4.4 衍生用移液管准确吸取4 mL净化液在50 下用氮气缓缓地吹至近干，分别加入200 L正己烷和100 L三氟乙酸，涡旋30 s，在40 1 的恒温箱中衍生15 min，衍生结束后，在50 下用氮气缓缓地将净化液吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，过0.22 m滤膜，收集滤液

32、于进样瓶中以备进样。9.4.5 色谱参考条件流动相：A相：水，B相：乙腈-甲醇溶液（9.2.2.4）。梯度洗脱条件：24 % B（06 min），35 % B（8.010.0 min），100 % B（10.211.2 min），24 % B（11.5 min）。流速：1.0 mL/min。色谱柱柱温：40 。进样量：50 L。荧光检测器：激发波长360 nm；发射波长440 nm。液相色谱图参见附录B中的图B-1。9.4.6 测定9.4.6.1 标准曲线绘制 系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测，以峰面积为纵坐标-浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。9.4.6.2 定量测定待测样液中

33、待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应重新按9.4.2、9.4.3和9.4.4进行处理后再进样分析。9.4.6.3 空白试验不称取试样，按9.4.2、9.4.3和9.4.4的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。9.5 计算结果按式（2）计算AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的残留量。 （2）式中：X试样中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的含量，单位为微克每千克，gkg-1；A试样中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的色谱峰的峰面积对应的浓度，单位为纳克每毫升，ngmL-1；V1试样提取液体积

34、（植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积；酱油、醋按定容总体积），单位毫升，mL；V2多功能柱后的取样液体积，单位毫升，mL；V3样品净化液的最终定容体积，单位毫升，mL；m试样的称样量，单位克，g；以重复性条件下获得的两次独立测XX果的算术平均值表示。计算结果保留三位有效数字。10 免疫亲和柱-柱后衍生法10.1 原理试样中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化净化去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质，净化液经液相色谱分离，柱后衍生（碘或溴试剂衍生、光化学衍生、电化学衍生等），经荧光检测器检测，外标法定量。10.2 试

35、剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。10.2.1 试剂10.2.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。10.2.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。10.2.1.3 氯化钠（NaCl）。10.2.1.4 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。10.2.1.5 磷酸二氢钾（KH2PO4）。10.2.1.6 氯化钾（KCl）。10.2.1.7 浓盐酸（HCl）。10.2.1.8 Triton X -100（C14H22O（C2H4O）n）（或吐温-20，C58H114O26）。10.2.1.9 碘（I2）。10.2.1.10 三溴化吡啶（C5H6Br3N2

36、）。10.2.1.11 溴化钾（KBr）。10.2.1.12 浓硝酸（HNO3）。10.2.1.13 氮气：纯度 99.9 %。10.2.2. 试剂配制10.2.2.1 乙腈-水溶液（84+16）：取840 mL乙腈加入160 mL水。10.2.2.2 甲醇-水溶液（70+30）：取700 mL甲醇加入300 mL水10.2.2.3 乙腈-水溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL水。10.2.2.4 乙腈-水溶液（10+90）：取100 mL乙腈加入900 mL水。10.2.2.5 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。10.2.2.6 磷酸盐缓

37、冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00 g氯化钠，1.20 g磷酸氢二钠（或2.92 g十二水磷酸氢二钠），0.20 g磷酸二氢钾，0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH值至7.4，用水定容至1000 mL。10.2.2.7 1 %Triton X -100（或吐温-20）的PBS：取10 mLTriton X -100，用PBS定容至1000 mL。10.2.2.8 0.05 %碘溶液：称取0.1g碘，用20 mL甲醇溶解，加水定容至200mL，用0.45 m的滤膜过滤，现配现用。（碘柱后衍生法使用）。10.2.2.9 5 mg/L三溴化吡啶水溶液：称取5 mg三溴化吡啶溶

38、于1 L水中，用0.45 m的滤膜过滤，现配现用。（溴柱后衍生法使用）。10.2.3 标准品10.2.3.1 AFT B1标准品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8 ）：纯度98 %。10.2.3.2 AFT B2标准品（C17H14O6 ，CAS：7220-81-7 ）：纯度98 %。10.2.3.3 AFT G1标准品（C17H12O7 ，CAS：1165-39-5 ）：纯度98 %。10.2.3.4 AFT G2标准品C17H14O7 ，CAS：7241-98-7 ）：纯度98 %。10.2.4 标准溶液配制10.2.4.1 标准储备溶液（10 g/mL）：分别称取AFT B

39、1、AFT B2、AFT G1和AFT G2 1 mg（精确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液浓度约为10 g/mL。溶液转移至试剂瓶中后，在-20下避光保存，备用。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。10.2.4.2 混合标准储备溶液（1.0 g/mL）：分别准确吸取10 g/mLAFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2标准储备液各1.00mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，得到1.0 g/mL的混合标准液。此溶液密封后避光-20 保存，三个月有效。10.2.4.3 混合标准工作液（AFT B1和AFT G1：100 ng/mL，A

40、FT B2和AFT G2：30 ng/mL）：准确移取AFT B1和AFT G1标准储备溶液各1 mL，AFT B2和AFT G2标准储备溶液各300 L至10 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光4 下保存，三个月内有效。10.2.4.4 标准系列工作溶液：分别准确移取混合标准工作液（10.2.4.3）10 L、50 L、200 L、500 L、1000 L、2000 L、4000 L至10 mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度（含AFT B1和AFT G1浓度为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL，AFT B2和AFT G2浓度为0.03、0.15、0.6

41、、1.5、3.0、6.0、12 ng/mL的系列标准溶液）。10.3 仪器和设备10.3.1 匀浆机。10.3.2 高速粉碎机。10.3.3 组织捣碎机。10.3.4 超声波震荡器10.3.5 天平：感量0.01 g和0.00001 g。10.3.6 涡旋混合器。10.3.7 高速均质器：转速6，500-24，000 转/min。10.3.8 离心机：转速6000 转/min。10.3.9 真空泵。10.3.10 氮吹仪。10.3.11 液相色谱仪：配荧光检测器（带一般体积流动池或者大体积流通池）。注：当带大体积流通池时不需要再使用任何型号或任何方式的柱后衍生器。10.3.12 液相色谱柱：C

42、18柱（柱长150 mm，柱内径4.6 mm；填料粒径5 m），或相当者。（柱后衍生方法使用）C18柱（柱长100 mm，柱内径2.1 mm；填料粒径1.7 m），或相当者。（大流通池检测使用）10.3.13 光化学柱后衍生器。10.3.14 溶剂柱后衍生装置。10.3.15 电化学柱后衍生器。10.3.16 50 mL具塞PVC离心管。10.3.17 移液管：1.0 mL，5.0 mL，20.0 mL。10.3.18 50 mL一次性注射器（使用注射器筒部分）。10.3.19 免疫亲和柱：柱容量 300 ng，其中AFT G2的交叉反应率 80 %。（柱容量验证方法参见附录A.2）注：对于每

43、个批次的亲和柱使用前需质量验证。10.3.20 多功能柱或功能相当的固相萃取柱：对复杂基质样品测定时使用。10.3.21 一次性微孔滤头：带0.22 m微孔滤膜。10.3.22 筛网：20目。10.3.23 带刻度的磨口玻璃试管：10 mL。10.4 分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。10.4.1 样品制备同9.4.1 10.4.2 样品提取同9.4.2 10.4.3 净化10.4.3.1 上样液的准备准确移取4 mL上述上清液，加入46 mL 1 %Triton X -100（或吐温-20）的PBS

44、（10.2.2.7）（使用甲醇-水溶液提取时可减半加入），混匀。10.4.3.2 免疫亲和柱的准备将50 mL注射器筒与亲和柱的顶部相连。10.4.3.3 试样的净化免疫亲和柱内的液体放弃后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1-3 mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入10 mL水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置10 mL刻度试管，取下50 mL的注射器筒，21 mL甲醇洗脱亲和柱，控制1-3 mL/min的下滴速度，收集全部洗脱液至刻度试管中，继续用真空泵抽干亲和柱。在50 下用氮气缓缓

45、地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，0.22 m滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。注：全自动（在线）或半自动（离线）的固相萃取仪器可优化操作参数后使用.10.4.3.4 多功能柱和免疫亲和柱同时使用（对花椒、胡椒和辣椒等复杂基质）10.4.3.4.1 多功能柱净化移取8 mL上清液，按多功能柱操作说明进行净化，收集全部净化液。10.4.3.4.2 免疫亲和柱净化 用刻度移液管准确吸取上部净化液4 mL，加入46 mL 1% Triton X -100（或吐温-20）的PBS（使用甲醇-水溶液提取时可减半加入），混匀。按10.4.3.2和10.4.3.

46、3处理。10.4.4 液相色谱条件10.4.4.1 无衍生器法（大流通池直接检测）流动相：A相：水，B相：乙腈-甲醇（10.2.2.5）。 等梯度洗脱条件：A：65 %，B：35 %。流 速：0.3 mL/min。柱 温：40 。进样量：10 L。激发波长：365 nm，发射波长：436 nm（AFT B1、AFT B2），463nm（AFT G1、AFT G2）。液相色谱图见附录B中的图B-2。10.4.4.2 柱后光化学衍生法流动相：A相：水，B相：乙腈-甲醇。等梯度洗脱条件：A：68 %，B：32 %。流 速：1.0 mL/min。柱 温：40 。进样量：50 L。光化学柱后衍生器。激发

47、波长：360 nm；发射波长：440 nm。液相色谱图见附录B中的图B-3。10.4.4.3 柱后碘或溴试剂衍生法10.4.4.3.1 柱后碘衍生法流动相：A相：水，B相：乙腈-甲醇。等梯度洗脱条件：A：68 %，B：32 %。流 速：1.0 mL/min。柱 温：40 。进样量：50 L。柱后衍生化系统。衍生溶液：0.05 %碘溶液（10.2.2.8）。衍生溶液流速：0.2 mL/min。衍生反应管温度：70 。激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。液相色谱图见附录B中的图B-4。10.4.4.3.2 柱后溴衍生法流动相：A相：水，B相：乙腈-甲醇。等梯度洗脱条件：A：68 %，B

48、：32 %。流速：1.0 mL/min。色谱柱柱温：40 。进样量：50 L。柱后衍生系统。衍生溶液：5 mg/L三溴化吡啶水溶液（10.2.2.9）。衍生溶液流速：0.2 mL/min。衍生反应管温度：70 。激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。液相色谱图见附录B中的图B-5。10.4.4.4 柱后电化学衍生法流动相：A相：水（1L水中含119 mg 溴化钾，350 L 4mol/L硝酸）；B相：甲醇柱 温：40 。流 速：1.0 mL/min。进样量：50 L。电化学柱后衍生器。激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。液相色谱图见附录B中的图B-6。10.4.5 测定1

49、0.4.5.1 标准曲线绘制将标准系列溶液（10.2.4.4）由低到高浓度依次进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。10.4.5.2 定量测定待测样液中的目标化合物响应值应在标准曲线线性范围内，若有含量浓度超过线性范围的待测样品则应重新按10.4.2和10.4.3进行处理后进样分析。10.4.5.3 空白试验不称取试样，按10.4.2和10.4.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。10.5 分析结果的表述按式（3）计算AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的残留量。 （3）式中：X试样中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2 的含量

50、，单位为微克每千克，gkg-1；A试样中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的色谱峰的峰面积相对应的浓度，单位为纳克每毫升，ngmL-1；V1试样提取液体积（植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积；酱油、醋按定容总体积），单位毫升，mL； V2用于免疫亲和柱净化的上清液体积，单位毫升，mL；V3样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升，mL；m试样的称样量，单位克，g；以重复性条件下获得的两次独立测XX果的算术平均值表示。计算结果保留三位有效数字。11 其他本方法的定量限：柱后光化学衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后电化学衍生法检出限为AFT B1：0.03 g/kg、AF

51、T B2：0.01 g/kg、AFT G1：0.03 g/kg、AFT G2：0.01 g/kg，定量限为AFT B1：0.1 g/kg、AFT B2：0.03 g/kg、AFT G1：0.1 g/kg、AFT G2：0.03 g/kg； 无衍生器法检出限为：AFT B1：0.017 g/kg、AFT B2：0.003 g/kg、AFT G1：0.017 g/kg、AFT G2：0.003 g/kg；定量限为AFT B1：0.05 g/kg、AFT B2：0.01 g/kg、AFT G1：0.05 g/kg、AFT G2：0.01 g/kg。第三法 薄层色谱法11 范围本标准规定了应用薄层色谱

52、法测定食品中AFT B1的测定方法。 本标准适用于GB2761-2011中规定的各类食品（谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品和特殊膳食用食品等）中AFT B1含量的测定。 12 原理样品经提取、浓缩、薄层分离后，AFT B1在紫外光（波长365 nm）下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。13 试剂和材料 注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。13.1 试剂13.1.1 甲醇（CH3OH）。13.1.2 正己烷或石油醚（沸程30 -60 或60 -90 ）。 13.1.3 三氯甲烷（CHCl3）。13

53、.1.4 苯（C6H6）。13.1.5 乙腈（CH3CN）。13.1.6 无水乙醚（C2H6O）。13.1.7 丙酮（C3H6O）。以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。13.1.8 硅胶G：层析用。13.1.9 三氟乙酸（CF3COOH）。13.1.10 无水硫酸钠（NaSO4）。13.1.11 氯化钠（NaCl）。13.2 试剂配制13.2.1 苯-乙腈混合液：量取98 mL苯，加2 mL乙腈，混匀。 13.2.2 甲醇水溶液：55+45。取550 mL甲醇加入450 mL水。13.2.3 次氯酸钠溶液（消毒用）：取100 g漂白粉，加入500

54、mL水，搅拌均匀.另将80 g工业用碳酸钠 （Na2CO310H2O）溶于500 mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25 g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50 g/L。污染的玻璃仪器用10 g/L氯酸钠溶液浸泡半天或用50 g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。13.3 标准品AFT B1标准品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8 ）：纯度98 %。13.4 标准溶液配制13.4.1 黄曲霉霉素B1标准储备溶液：准确称取1 mg-1.2 mg AFT B1标准品，先加入2 mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100

55、mL，避光，置于4 冰箱保存，此溶液浓度约10 g/mL。 纯度的测定：取5 L 10 g/mLAFT B1标准溶液，滴加于涂层厚度0.25 mm的硅胶G 薄层板上，用甲醇，三氯甲烷（4+96）与丙酮-三氯甲烷（8+92）展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，应符合以下条件： 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。 原点上没有任何残留的荧光物质。13.4.2 AFT B1标准工作液：准确吸取1 mL标准溶液（10 g/mL）于10 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合被至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0 g AFT B1。吸取1.0 mL此稀释液，置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀

56、释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2 g AFT B1。再吸取AFT Bl标准榕液（0.2 g/mL）l.0 mL置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度.此溶液每毫升相当于0.04 g AFT B1。14 仪器和设备14.1 10目圆孔筛。14.2 小型粉碎机。14.3 电动振荡器。14.4 全玻璃浓缩器。14.5 玻璃板：5 cm20 cm。 14.6 薄层板涂布器。14.7 展开槽：长25 cm，宽6 cm，高4 cm。 14.8 紫外光灯：100 W125 W，带365 nm滤光片。14.9 微量注射器或血色素吸管。15 分析步骤 整个操作需在暗室条件下进行。15.1 样品提取

57、15.1.1 玉米、大米、小麦、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等15.1.1.1 甲法：称取20.00 g粉碎过筛试试样（面粉、花生酱不需粉碎），置于250 mL具塞锥形瓶中，加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30 min，静置片 刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水带被分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00 mL甲醇水溶液（相当于4g试样）置于另一125 mL分液漏斗中，加20 mL三氯甲烷，振摇2 min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10 g预先用三氯甲烷湿润

58、的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50 mL蒸发皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发血放在通风柜于65 水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2 min-3 min后，准确加入1 mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1 mL苯-乙腊混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2 mL具塞试管中。15.1.1.2 乙法（限于玉米、大米、小麦及其制品）：称取20.00 g粉碎过筛

59、试样于250 mL具塞锥形瓶中，用滴管滴如约6 mL水，使试样湿润，准确加入60 mL三氯甲烷，振荡30 min，加12 g无水硫酸钠，振摇后，静置30 min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100 mL具塞锥形瓶中。取12 mL滤液（相当4g试样）于蒸发皿中，在65水浴锅上通风挥干，准确加入1 mL苯-乙腈混合液，以下按15.1.1.1自用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合起依法操作。15.1.2 花生油、香油、菜油等称取4.00 g试样置于小烧杯中，用20 mL正己烷或石油醚将试样移于125 mL分液漏斗中。用20 mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2 min，静置分

60、层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5 mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20 mL三氯甲烷，以下按15.1.1.1自振摇2 min，静置分层起依法操作。15.1.3 酱油、醋称取10.00 g试样于小烧杯中，为防止提取时乳化，加0.4 g氯化钠，移入分液漏斗中，用15 mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，挽液井人洗液并入分液漏斗中。以下按15.1.1.1自振摇2 min，静置分层起依法操作，最后加入2.5 mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相当于4 g试样。或称取10.00 g试样，置于分液漏斗中，再加12 mL甲醇（以酱油体积代替水，故甲