聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应

1、聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应【摘要】目的以自行合成的聚乙烯亚胺(plyethyleniine,PEi)纳米凝胶为载体转染E1A基因，并观察E1A基因对肝癌细胞体外生长的抑制作用及其对化疗药物的增敏效应，初步讨论其作用机制。方法经PEI介导，将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌H22细胞，RT-PR证实其转染，G418挑选出阳性克隆细胞，观察EIA基因对该细胞系生长的抑制作用。用TT法测定转染E1A基因前后，顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶、博来霉素对肝癌H22细胞的效应。结果质粒psv-E1A测序结果与基因库E1A基因序列完全相符。G418挑选出阳性克隆

2、细胞。RT-PR结果显示PEI能转染质粒psv-E1A并有稳定的表达。转染E1A基因后，H22-E1A细胞对顺铂、博来霉索、泰素的敏感性显著进步P0.01，而对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显变化P0.05。结论PEI能正常转染质粒psv-E1A,E1A基因可以明显抑制肝癌H22细胞的生长，并明显进步其对顺铂、博来霉索及泰素等化疗药物和放射线的敏感性。其机制可能与E1A基因改变肿瘤细胞的增殖状态和细胞周期时相有关。【关键词】E1A基因；基因转染；肝癌细胞；聚乙烯亚胺；四甲基偶氨唑盐微量染色法基因治疗的载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。由于病毒载体有免疫原性高、毒性大、目的基因容量孝靶向特异性

3、差、制备较复杂及费用较高等缺点，人们愈来愈重视非病毒载体的研究。非病毒载体较平安，免疫原性低,而且是基于质粒的转染，易于组装。聚乙烯亚胺(plyethyleniine,PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体之一，1995年，Bussif等1首先报道了PEI可作为非病毒载体。其后,PEI成为非病毒载体研究开展最快的领域，其中线型和支链状的PEI是研究最活泼、基因转导效率最高的阳离子聚合物之一。基因治疗的另一个关键是目的基因，E1A基因可以作用于肿瘤细胞的多个癌基因和抑癌基因，如调控p53、HER-2/neu、RB和n23等癌基因和抑癌基因；并且E1A基因的作用不依赖肿瘤细胞的基

4、因状态，这使得E1A基因治疗较其他针对单一癌基因或抑癌基因的基因治疗(如p53基因)具有更好的应用价值和前景。本研究以PEI为载体，将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌细胞系H22，RT-PR证实其转染，用TT法测定转染E1A基因前后，顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶5-Fu、博来霉素对肿瘤细胞敏感性的作用,对说明高分子树枝状纳米载体在肿瘤靶向治疗中的平安、有效转导机制有重要意义和较大的应用价值。1材料和方法1.1材料1.1.1PEI纳米凝胶本课题利用掌握粒径准确可控纳米凝胶光化合合成方法，以水溶液光化学法合成具有各种粒径的PEI纳米凝胶2-3。详细参数见表1。表1PEI的参

5、数略1.1.2psv-E1A质粒由上海东方肝胆医院苏长青教授惠赠,在DH5-菌株中扩增，用DNA质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)制备质粒。质粒D260/D280比值在1.61.9之间,过滤除菌，20保存。1.1.3转染细胞H22肝癌细胞购自南京凯基生物科技开展，生长在含10%小牛血清FS的RPI1640培养基中。1.2方法1.2.1实验步骤本实验应用PEI转染质粒psv-E1A入肝癌细胞，G418挑选其阳性克隆细胞，RT-PR证实，分别加顺铂、博来霉素、泰素、5-Fu入阳性克隆细胞及未转染的细胞，24h后TT法测量生存率,观察E1A基因对多种作用机制不一样的化疗药物有无增敏作用。1.2.2基

6、因设计与测序从基因库内查E1A基因序列,并设计引物。上游引物：5-ggaggtgttattagaag-3；下游引物:5-tgtatgggtggaaag-3。E1A基因测序结果与从基因库内下载的E1A基因序列完全一致。1.2.3基因转染转染复合物的N/P比值对转染效率的影响很大。N/P比值指的是转染复合物中PEI分子所含的N原子与DNA分子中所含的P原子的摩尔比。1g的DNA分子中含有3nl的P原子。按照不同的N/P比值调整PEI溶液(4.3g/l)的使用量(表2)。表2不同N/P比值的PEI溶液的使用量略1.2.4PR反响按表3制备50lPR反响：离心数秒，上PR仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果

7、。表3PR反响组成略1.2.5琼脂糖凝胶电泳9lDNA样品中参加2l上样缓冲液混匀，混匀后的样品参加样品口中上样,100V、60A电泳30in。转贴于论文联盟.ll.1.2.6E1A基因的化疗增敏性1.2.6.1将H22肝癌细胞及H22-E1A肝癌细胞分别接种到96孔板上，密度为5000个细胞每孔，每孔0.2l10%FS的RPI1640培养液。1.2.6.2细胞培养24h后，7080亚集合态时，吸去培养液，分别参加不同浓度12.5、25、50、100l/L的顺铂培养液处理细胞,每个浓度设6孔。1.2.6.3细胞培养24h后，吸去培养液,每孔参加100l含5g/lTT无血清的RPI1640，细胞

8、37温育4h。1.2.6.4翻板法弃取液体，每孔参加100l二甲基亚砜(DS)，震荡10in，在酶标检测仪上490n及570n波长处读取光密度D值。酶标仪使用无细胞的RPI1640培养液校正。1.2.6.5同样的方法取对数生长期的H22和H22-E1A肝癌细胞接种96孔培养板，每孔接种5104个细胞，每组均设空白对照。7080亚集合态时，分别用不同浓度顺铂、泰素、博来霉素、5-Fu处理细胞，每个浓度设6孔。24h后用TT法测定D492。1.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件进展统计学处理。实验数据以s表示，E1A基因对细胞生长速度的影响及E1A基因的化疗增敏性采用配伍组方差分析t检验，P

9、0.05为统计学上有显著性差异。2结果2.1E1A基因对顺铂化疗的作用TT法测定不同浓度顺铂处理H22和H22-E1A细胞的D值492n见表4。不同浓度顺铂处理后H22和H22-E1A细胞的D值之间均有统计学差异P0.05；不同浓度顺铂与对照组之间亦有统计学差异P0.05。对照组之间无统计学差异P0.05。提示E1A基因对顺铂化疗有增敏作用。表4不同浓度顺铂对H22和H22-E1A细胞增殖的影响略2.2E1A基因对泰素化疗的作用TT法测定不同浓度泰素处理H22和H22-E1A细胞的D值492n见表5，不同浓度泰素处理后H22和H22-E1A细胞的D值之间均有统计学差异P0.05。对照组之间无统

10、计学差异P0.05。提示E1A基因对泰素化疗有增敏作用。表5不同浓度泰素对H22和H22-E1A细胞增殖的影响略2.3E1A基因对5-Fu化疗的作用TT法测定不同浓度5Fu处理H22和H22-E1A细胞的D值492n见表6，不同浓度5-Fu处理后H22和H22-E1A细胞的D值之间均无统计学差异P0.05；不同浓度5-Fu与对照组之间亦无统计学差异P0.05。对照组之间无统计学差异P0.05。提示E1A基因对5-Fu化疗无增敏作用。表6不同浓度5-Fu对H22和H22-E1A细胞增殖的影响略2.4E1A基因对博来霉素化疗的作用TT法测定不同浓度博来霉素处理H22和H22-E1A细胞的D值492

11、n见表7，不同浓度博来霉素处理后H22和H22-E1A细胞的D值之间均有统计学差异P0.05；对照组之间无统计学差异P0.05。提示E1A基因对博来霉素化疗有增敏作用。表7不同浓度博来霉素对H22和H22-E1A细胞的影响略3讨论基因治疗的主要目的就是将基因材料输送到细胞中去以改变它的功能，从而使得生物有机体可以正常地运转。选择适宜的载体,使目的基因靶向、可控并有效表达,是基因治疗成功的关键。1995年,Bussif等1首先报道了PEi可作为非病毒载体,浓缩DNA,并黏附到细胞膜上,进入细胞内,使真核表达质粒在细胞内表达，其后，PEI成为非病毒载体研究最快的领域。目前国内尚无商品化的PEI提供

12、。作为具有抑制肿瘤作用的基因，腺病毒5型E1A基因在肿瘤细胞的基因调控及治疗方面发挥较重要的作用。E1A基因转录后经过不同的拼接产生12S和13S两种RNA，分别翻译243R和289R两种主要的蛋白产物。E1A-289R共有3个功能区，即N-末端Rl、R2、R3区。E1A-243R除了不具有R3区外，其他与E1A-289R一样。N-末端的RI区通过与转录调节子P300BP结合，能抑制HER-2neu基因的表达；R2区与Rb蛋白家族结合；R3区是转录活化区4-5。E1A基因可以作用于肿瘤细胞的多个癌基因和抑癌基因，如调控p53、HER-2neu、RB和n23等癌基因和抑癌基因；并且E1A基因的作

13、用不依赖肿瘤细胞的基因状态6，这使得E1A基因治疗较其他针对单一癌基因或抑癌基因为目的的基因治疗(如p53基因)具有更好的应用价值和前景。PEI与DNA的结合主要是通过电荷作用,当DNA与一种适宜的阳离子聚合物分子结合时,带负电荷的DNA分子被缩合成浓聚的、有序的、直径为50200n的纳米粒子,这是非病毒阳离子聚合物载体的超分子化学作用的基矗本实验显示PEI作为非病毒载体能转染E1A基因入H22肝癌细胞并通过RT-PR证实之。姚元虎等7研究聚乙烯亚胺转导效率，聚乙烯亚胺转染绿色荧光蛋白质粒获得较高的转染率。生长速度和倍增时间是癌细胞的恶性表型之一,本实验显示,H22-E1A细胞体外倍增时间明显

14、较H22细胞长，说明E1A基因在体内外能明显抑制肝癌细胞的增殖。近年来,分子肿瘤学研究已证明:在肿瘤细胞中可能同时存在着多种基因的异常。不管其功能如何,综合作用的结果最终导致细胞失控性增殖,破坏了正常的细胞周期。广义而论,凡能抑制癌细胞生长的因素,都很可能与其能阻滞癌细胞周期某个或几个时相有关。因此E1A基因抑制肝癌细胞的增殖可能与其对细胞周期的影响有关。在实验中我们进一步讨论了E1A基因对细胞周期的作用。如何进步肿瘤细胞对化、放疗的敏感性，是恶性肿瘤治疗方面受到人们普遍关心的问题。本研究结果显示：E1A基因可以使H22细胞对顺铂、泰素、博来霉素的敏感性进步。Hrtbagyi等8及Uen等9-