纳他霉素发酵生产实验

1、纳他霉素的发酵生产、分别纯化及检测组员：*生物工程【摘 要】7d 得到该菌孢子再将其接种到种子培育基中得到600mL 分 6 个摇瓶装的发酵培育基中进展纳他霉素发酵，得到了纳他霉素产物 0.08g，并在整个试验过程定时镜检观看菌体形态变化及测量发酵密，发酵后期菌体大而疏松。【关键词】纳他霉素；发酵；纯化；镜检油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280，分子式C H 0 ,相对分子质量 665.75。纳他33 47 13霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5，其在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为 3050mg/L，引起的疾病的

2、治疗等。试验材料与方法材料：发酵菌种：褐黄孢链霉菌培育基：4g/L10 g/L4 g/L，琼脂 20 g/L；pH7.015 g/L10 g/L10 g/L；pH7.019.5 g/L50 g/L4 g/L 6g/L，pH7.0试验试剂：酵母提取粉，葡萄糖，琼脂，蛋白胨，氯化钠，大豆分别蛋白，麦芽糊精， 酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化剂BHA，1，2-丙二醇，纳他霉素标准品；试验仪器：250mL 三角瓶，摇床，生化培育箱，离心机，紫外分光光度计。方法：121灭菌 15min,摆斜面冷却后3712d，备用，用斜面转接收接种，2510d，待孢子长满后，放置冰箱5d200mL，平分装

3、在两个三角锥瓶中，12125min529，200r/min24h，无菌取样，涂片观看种子菌球形态，并显微拍照。摇瓶发酵：按摇瓶发酵培育基配方准确配培育基600mL, 平分装在 612125min1mL29，200r/min120168h24h1mL303nmOD态，并显微照相。OD48h24h0.5mL3034.5mL1h，12022r/min10min0.5mL4.5mL蒸馏水，摇匀，用紫外分光光度计在波长303nm 处测定光密度。标准曲线的制作：取50mg 纳他霉素，溶于100mL 丙二醇，得浓度为500ug/mL1OD 的值要求303相关系数R20.99产物浓度计算公式为：纳他霉素含量m

4、g/L=X100n式中，X 为将所测样品的浓度，100 为样品处理时两次稀释倍数之积；1 纳他霉素标准曲线工作表管号123456工作溶液浓度/(ug/mL)01020304050纳他霉素原液/mL 添加量00.81水/mLOD30310CK9.291.2.5 12022r/min 离心 10min。离心前发酵液的95%乙醇，20%氢氧化钠调pH110.，边加边搅拌0.5留意肯定要调过pH后再计时，以便纳他霉素充12022r/min 10min，保存上清液，将上清液用1mol/L 盐酸调 pH6.5，静置3冰箱，以便纳他霉素在等电点处沉淀析出；最终再12022

5、r/min离心10mi，保存沉淀产物，将产物置于5真空枯燥2，称重。试验结果与分析标准曲线制作结果：1 6 1mL 再4mL 5 倍OD 2 所示：表2纳他霉素标准曲线数据管号123456工作溶液浓度/(ug/mL)01020304050纳他霉素原液/mL 添加量00.81水/Ml9.29实际工作溶液浓度/(ug/mL)0246810OD30300.1370.2990.4170.5560.6691 所示：图1图1 纳他霉素标准曲线 0.53030.4O0024681012纳他霉素浓度ug/mL)如表3 所示表3定时测量

6、OD 值数据表培育时间/h487296144测得OD3030.0820.1030.1850.256纳他霉素浓度ug/mL1.0801.3922.6083.662菌体镜检结果:斜面菌镜检图片:图2斜面菌落图片图3斜面菌40 倍镜检图图4斜面菌100 倍镜检图局部 如图3、图4 可看到，此时接种到种子培育基前的菌体形态较小，需在100 倍镜下才能看到，菌丝多分裂成芽孢，菌丝量少；由图中可以看到有大量芽孢的存在，所以接种斜面以获得菌体芽孢的目的已到达，可以进展种子培育基接种了。24h 后菌体的镜检照片:图5种子菌40 倍镜检图图6种子菌100 倍镜检图5 可看到，此时很多芽孢已长成了菌体，菌体数量增

7、多，菌体形态由图6 可以看到此时菌体还比较小，但长成了四周有辐射状生长的短菌丝，中间一小部份实心；48h 镜检结果:图7 发酵48h 10倍镜检图图8 发酵48h 40倍镜检图9 48h 40 倍镜检图局部7 10 在数量上也增加了很多；由图8、图 9 可看到，此时菌体形态多为菌球形，即中间有一略呈 是作装片时打碎的；72h 镜检结果:图10发酵72h 10倍镜检图图11发酵72h 40 倍镜检图图12发酵72 h 40 倍镜检图局部10 72h 48h 1112 可看48h 时变大了，中部更致密周边菌丝更多更长了；96h 镜检结果:图13发酵96h 40 倍镜检图图14发酵96h 40 倍镜

8、检图局部由图13、图14 可以看到，此时菌体较48h 时也变大了，但中间原来致密的局部现变得较松散了，菌体在形态上也从略呈圆形变也了不规章状144h 镜检结果:图15发酵144h 10 倍镜检图图16发酵144h 40 倍镜检图局部 由图15 可看到，此时菌体数削减了，单个菌体变大了，其具体构造由图16 可看到菌体周边有大量的菌丝密密麻麻的中部较边上致密，此时的菌丝多而细；纳他霉素分别纯化结果：4 所示:表4产物分别纯化结果发酵液总体积/mL535.0离心后上清液体积/mL497.0湿菌泥体积/mL38产物干重/g0.084 0.08g3 OD 值得到3.662 ug/mL，由此算出理论上的产

9、物量为：3.662535.0=1959.17ug0.02g产物不纯的最有可能的一个操作环节是在往离心得的湿菌泥加两倍95%乙醇并调pH 充分搅拌后拿去离心时的离心环节上，由于离心时因离心机坏了，我们试验时只能用转速才3000rpm 的离心机,这与试验要求的 12022rpm 相差很大而致使还有很多杂质残留在上清液OD 物量比用于测量的那瓶要多。试验结果综合分析：本试验通过对整个发酵过程定时观看菌体的变化，发酵现菌体数量的发酵过程中先是快速增多，增多到肯定数量后开头有所削减，这从图710 15 可看出；另外还觉察菌100 倍镜下才能看到；在种子培育基中培育24h 后，菌体变大，菌体四周长出了菌丝

10、；发酵48h 后，菌体明显变大，在 40 倍镜下也能清楚的看到，菌丝增多且聚拢成球状；发酵 72h且由所测OD 值数据3可知此时正处于发酵的旺盛时期；发酵96h 后，菌体形态变得较松散也较大了，没有明显的致密圆球形了，而到144h 后菌体变得更大，菌比多而细且聚积得较松散，事形态呈不规章状，并通过对其OD 96 小时以后菌体发酵量相对于之前下降了很多，说明此阶段菌体生产力量开头减弱；以上结果可综合上面图4、69121416可看出。【参考文献】1 雷德柱，胡位荣. 生物工程中游技术试验手册. 科学出版社，2022，96-100.2 HYPERLINK “ :/d.g.wanfangdata .cn/Thesis_Y1521854.aspx“ :/d.g.wanfangdata .cn/Thesis_Y1521854.aspx3 张龙翔. 生化试验方法和技术M.北京：高等教育出版社，1997：1-3.4 周德庆2022微生物学教程高等教育出版社，北京。5 HYPERLINK “ :/wenku.baidu /view/43a0c507e87101f69e3195e3.html“ :/wenku.baidu /view/43a0c507e87101f69