中青年优秀论文评奖

1、中青年优秀论文评奖电针刺对手术创伤大鼠脾T淋巴细胞IL-2、IFN-y及ERK信号通路的影响哈尔滨医科大学附属肿瘤医院麻醉科（黑龙江哈尔滨150081）王坤王国年针刺疗法是我国传统医学的瑰宝，许多证据表明电针刺“足三 里”和“阑尾”穴能明显改善创伤诱导的免疫抑制，但是这种作用的 分子机制尚未十分明确。胞外信号调节激酶 （extracellular-regulated protein kinasel/2, ERK1/2） 是丝裂 原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族 一员，在细胞信号转导网络屮处于枢纽地位，与辅助性T细胞分化有 关。那

2、么，电针刺是否可以通过活化ERK信号通路，促进IL-2、IFN-y 炎症因了mRNA表达和蛋白生成，进而提高脾脏T细胞免疫功能，目前 尚不清楚。目的：观察电针刺“足三里”和“阑尾”穴对手术创伤大鼠脾脏T细 胞内IL-2、IFN-y和ERK信号转导通路的影响，探讨其保护作用的分子 机制，旨在为临床探索术后免疫功能治疗提供新思路。方法：健康雄 性SD大鼠32只随机分为:正常对照组（Control组，n=8）、单纯电针 组（EA组,n=8）、创伤组（Trauma组,n=8）和创伤后电针组（T + EA组,n=8) o采用手术创伤致术后免疫抑制方法造模，大鼠术前12h 禁食、自由饮水，经腹腔注射戊巴比

3、妥钠(40mg/kg)麻醉后，分别 沿大鼠背部中线、腹部中线作6cm和5cm的纵行切口，背部切口以暴 露脊柱为度，腹部作纵行切口后，暴露腹部脏器3分钟，以检查有无 病灶及损伤，然后关闭腹腔。选取双侧足阳明胃经上的“足三里”、“阑尾”穴进行电针刺激，疏密波(60 Hz, 1.05秒和2 Hz, 2. 85秒 交替)，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜(W1 mA),持续30 min,每日1次，共3次。于术后3天无菌取脾，尼龙毛柱法分离脾脏T淋巴细胞，用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录聚合酶 链反应(RT-PCR)分别检测脾脏T淋巴细胞内IL-2JFN-Y蛋白和mRNA 表达；应用W

4、estern blot检测ERK1/2表达；ERK1/2下游核转录因了NF-zcB和AP-1 表达测定,采用Trans-AM ELISA-basecl kits 分析法。 结果：(1) EA组脾脏T淋巴细胞内IL-2 IFN-y蛋白和mRNA表达， 与Control组比较没有明显改变；手术创伤后IL2利FNy蛋白和mRNA 表达明显降低，Trauma组与Control组比较有显著差异(戶 0.001)； 给予电针刺处理后IL2、IFN-y蛋白和mRNA表达明显增加，T + EA 组与Trauma组比较有明显差异(P = 0.002)。(2)脾脏T淋巴细胞内 total-ERKl/2及p-ERK

5、l/2、NF-/cB和AP-1 的DNA连接活性，EA组与 Control组比较无明显差异；手术创伤后p-ERKl/2表达、NF-/cB和AP1 的DNA连接活性明显降低，Trauma组与Control组比较有明显差异(P 0.001)；给予电针刺处理后P-ERK1/2表达、NF-kB和AP1的DNA 连接活性明显增加，T + EA组与Trauma组比较有统计学差异(P 0.001) o结论：电针刺“足三里”和“阑尾”可以提高创伤大鼠脾 脏T细胞内IL2、IFN-y蛋白和mRNA的表达，激活其免疫功能，改善术 后免疫抑制状态，这种保护作用与提高ERK1/2. NF-kB和AP-1活性 密切和关

6、。这一发现对于理解电针刺免疫调节机制和临床应用具有重 耍意义。关键词:电针；手术创伤;IL-2； IFN-y； ERK1/2AbstractBACKGROUND: the aim of our study was to investigate the effects of EA on the IL-2 and IFN-y protein and mRNA expressions, as well as extracellular-regulated protein kinase (ERK) signaling pathway, and evaluate the signaling regula

7、tory mechanism of EA effects. METHODS: 32 male SD rats were divided randomly into four groups (Control, EA, Trauma, and T + EA group, n=8/group). Rats were fasted overnight but allowed water ad libitum before the experiment. Directly prior to surgery, rats were anesthetized with an intraperitoneal i

8、njection of pentobarbital sodium (40 mg/kg). Rats were aseptically incised longitudinally to a length of 6 cm along the dorsal median line and 5 cm along the abdominal median line, and the abdominal viscera were exposed for 3 min. After making sure there was no bleeding in the abdominal cavity, the

9、wound was sutured. EA was applied at ”Zusanli” and nLanwein acupoints after operation, lasting for 30 min once a day. EA parameters were set as alternating strings of dense-disperse frequencies (60 Hz for 1.05 s and 2 Hz for 2.85 s alternately), and the intensity was adjusted to induce moderate musc

10、le contract of the hindlimb (1 mA). At postoperative day 3, splenic T cells were isolated using the nylon column method. Interleukin (IL)-2 and interferon (IFN)-y protein and their mRNA expressions were assayed by ELISA and RT-PCR, respectively. To characterize the mechanism for the transcription re

11、gulation of EA on cytokine expression, we examine the activity of ERK1/2 signaling pathway using Western blot analysis, and the DNA binding activity of nuclear factor (NF)- kB and activator protein (AP)-l using Trans-AM ELISA-based kits. RESULTS: (1) The results showed that IL-2 and IFN-y protein an

12、d their mRNA expressions in splenic T cells of traumatized rats were markedly decreased 3 days after operation (P 0.001, Trauma group vs. Control group). (2) This was accompanied with a significant depression in the activity of ERK1/2、NF-/cB and AP-1 (P 0.001, Trauma group vs. Control group). EA adm

13、inistration increased these cytokine production and mRNA expressions (P 0.05, T 十 EA group vs. Trauma group), and prevented the suppression of ERK1/2 activation as well as NF-/cB and AP-1 DNA binding activity (P 0.001, T + EA group vs. Trauma group). CONCLUSIONS: EA regulates IL-2 and IFN-y at prote

14、in and mRNA level in splenic T cells, and, at least in part, involves the signaling pathways of ERK1/2 as well as NF-kB and AP-1. These findings suggest that EA may ameliorate impaired immune function in the postoperative state and may be used often to release the immunosuppression following surgica

15、l trauma clinically.Keywords: Electroacupuncture; surgical trauma; IL-2; IFN-y; ERK外科手术作为一种临床常见的诊疗手段，在治疗疾病的同时由于 手术造成的创伤，不可避免地影响了免疫系统的功能，可致机体的免 疫功能受抑，进而引起感染、多器官功能衰竭，甚至死亡。因此如何 纠正创伤后的免疫功能低下是控制伤后感染及改善预后的关键。针刺 疗法是我国传统医学的瑰宝，具有经济、简便、安全、有效的优点， 可用于治疗许多疾病，最为常见的作用是缓解疼痛，但针刺的作用决 不仅限于此，许多证据表明电针刺“足三里”和“阑尾”穴能明显改 善创

16、伤诱导的免疫抑制，但是这种作用的分子机制尚未十分明确。丝裂原活化蛋白激酶(mitogemactivated protein kinase, MAPK) 信号通路是当今生物医学和临床医学研究的热门话题，它是将信号从 细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，参与基因表达调控、细胞功 能活动(如增殖、分化、转化及凋亡等)及机体多种生理病理过程。 近年来研究发现，MAPK信号转导途径可以诱导初始CD4T细胞向1型 辅助性T细胞(helper T cell 1, Thl)或Th2分化，从而引发不同的免 疫反应。ERK1/2信号通路在细胞信号转导网络中处于枢纽地位，与 辅助性T细胞分化有关。那么，电针是否可以

17、通过提高ERK信号通路 的表达，促进IL-2. IFN-y炎症因子mRNA表达和蛋片生成，进而提高 脾脏T细胞免疫功能，目前尚不清楚。因此，本实验观察电针刺“足 三里”和“阑尾”穴对手术创伤后大鼠脾脏T细胞内IL2、IFN-y和 ERK1/2信号转导通路的影响，探讨其保护作用的分了机制，旨在为 临床探索术后免疫功能治疗提供新的思路。实验方法1.1实验动物雄性健康成年Sprague-Dawley人鼠，清洁级，体重200士20g,购 于北京维通利华公司实验动物中心。由哈尔滨医科大学公共卫生学院 实验动物中心饲养，每四只一组饲养于笼内，光照与熄灯各12小时， 保持在安静环境中，温度维持恒温23 0.

18、5。湿度为40-60%,动物 自由饮水、进食。动物的处理符合国际实验动物使用准则。1.2免疫抑制模型的制作采用手术创伤致术后免疫抑制方法造模叫大鼠术前12h禁食、 自由饮水，经腹腔注射(i.p.)戊巴比妥钠(40mg/kg体重)麻醉后， 分别沿大鼠背部中线、腹部中线作6cm和5cm的纵行切口，背部切口 以暴露脊柱为度，腹部作纵行切口后，暴露腹部脏器3分钟，以检查 有无病灶及损伤，然后关闭腹腔。术后适当保暖，无术后感染发生。 13输穴的选择与针刺操作1.3. 1输穴选择根据古典医籍理论，选取双侧足阳明胃经上的“足三里”和“阑 尾”穴。“足三里”穴是针刺调节免疫的常用穴位，属足阳明胃经， 阳明经为

19、多气多血之经，脾胃乃后天之本，气血生化之源。针刺足三 里穴可以疏经通络，培补后天气血阴阳，扶助正气，增强机体抗病能 力。实验亦表明针刺“足三里”穴对免疫功能具有调节作用；“阑 尾”穴是一辅助穴。按照实验针灸学所附的常用实验动物的针灸 穴位的方法取穴。“足三里”穴：在小腿前外侧，当犊鼻下3寸，距胫骨前缘5 mm 处。“阑尾”穴：在“足三里”穴下3.3 mm处。1.3.2针具26号1寸华佗牌针灸针（直径0. 3 mm,长50 mm）,苏州针灸器 械厂生产。1.3.3针刺操作“足三里”穴：直刺5mm,连接电针仪负极。“阑尾”穴：直刺5mm,连接电针仪阳极。1.3.4电针刺参数将大鼠固定于特制的鼠板上

20、，头尾稍可活动，身体不能转动。针 后接电针仪（神经肌肉刺激仪SDZ-II,苏州针灸器械厂），疏密波（60 Hz, 1.05秒和2 Hz, 2. 85秒交替），强度以引起大鼠后肢肌肉轻微 抖动而不嘶叫为宜（W1 mA）,持续30 min,每日1次，共3次。（2）实验分组及处理按随机数字表将32只大鼠分为止常对照组（Control组，n二8）、 单纯电针组（EA组，n二8）、创伤组（Tratima组，n二8）和创伤后电 针组（T + EA组，n二8） o各组处理如下： 正常对照组：不造模，于实验开始后与创伤后电针组用同样的方法， 同样的时间固定，每次30分钟，但不行电针刺激；单纯电针组：仅电针，不

21、造模，I古I定方法同正常对照组；创伤组：按照上述手术模型制作方法，于实验开始第一天，建立手术 创伤免疫抑制模型，不电针。其它处理同正常对照组；创伤后电针组：于实验开始第一天首先造模，其方法同创伤组。动物 于清醒状态下，将大鼠固定于特制的鼠板上，头尾稍可活动，身体不 能转动，于实验第2天开始电针，每日同一吋辰于双侧“足三里”、“阑尾”穴连续刺激30 min,持续3天。标本的采集与检测31脾脏T淋巴细胞悬液制备将大鼠断头处死，立即消毒，在无菌工作台上，剖取脾脏进行处 理。按常规制备脾细胞悬液，采用尼龙毛柱法分离脾脏中的T细胞。 酸性a-醋酸蔡酚酯酶(ANAE)染色法鉴定T细胞纯度92%,台盼蓝 染

22、色试验证明分离出的T细胞活力95%。3. 2观察指标及检测方法3. 2. 1脾脏T淋巴细胞内IL2利FNy蛋白表达测定:用酶联免疫吸附试 验(ELISA)检测IL2利FNy蛋白含量，按照南京建成生物工程公司 试剂盒说明书进行操作。3.2.2脾脏丁淋巴细胞内IL2和IFN.ymRNA表达测定：加入Trizol提 取总RNA,测定其浓度并计算其纯度。以Oligo(dt)为引物逆转录合 成cDNA,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对转录产物扩增，GAPDH 作内参。IL-2 (91 bp): S5JGACGCTGGAAATTTCATCAGC A-3；A5f-GCTCATCATCGAATTGGCA

23、CT C-3； IFN-y (140bp):S5-AGGCC ATC AGC A AC A AC AT A AGTG-3r, A5 GACAG CTTTGTGCTGGATCTGTG-3A； GAPDH (143bp): S 5r- GGC ACA GTC AAGGCT GAG AAT G-3A 5- ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA -3扩增产物先经1.5%琼脂糖凝胶电泳，再用澳化乙锭染色，扫描仪成像 后采用凝胶图像分析处理系统分析，以IL2、IFN*与GAPDH的积分 光度比值进行半定量，此即相对积分吸光度,籍此对比各组IL-2.IFN-Y mRNA的相对表达量。3.

24、2.3脾脏T淋巴细胞内ERK1/2表达测定：应用Western blot检测 MAPK信号通路ERK1/2总蛋白(total-ERKl/2 )及磷酸化ERK1/2(p-ERKl/2)的表达变化。取脾脏T淋巴细胞悬液，加入裂解液A (W/V:20%) , 4C下 18 000 r /min 离心lOmin。取上清测定BCA 蛋 白含量。将上清加至已配好的SDS分离胶和浓缩胶加样孔，进行 电泳。电泳结束后，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜。室温震荡封闭1小 时后，加入1:1000兔抗大鼠的total-ERKl/2及pERKl/2单克隆抗体孵 育，4C过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育lh后，T

25、BS 洗三次，用 BCIP/NBT 显色。弘actin 为内参照，用 Kadak digital Science ID扫描及分析系统分析膜上蛋白条带积分吸光度值，以total-ERKl/2或p-ERK 1 /2与相应B-actin蛋白的比值反映total-ERK 1 /2及p-ERK 1 /2的表达量。3. 2. 4脾脏T淋巴细胞内ERK下游核转录因子(nuclear factor-/cB,NFkB)和活化蛋白1 (activator protein-1, AP-1)表达测定：提取细 胞核蛋白，采用Trans-AM ELISA-based kits分析法测定NF讥B和AP-1 的表达。用核蛋白

26、提取试剂盒(Active Motif, Carlsbad, CA)提取细胞 核内蛋白后，加入NF我B和AP-1生物索酰化双链寡聚核昔酸包被的 96孔板，活化的转录因子连接到寡聚核昔酸上，通过抗NFkB p65、 cFos、cJun辣根过氧化物酶连接二抗，进行检测。统计学处理数据经SPSS 10.0软件进行统计分析，以均数土标准差(刁$)表 示。所测数据均进行正态检验和方差齐性检验，组间比较用单因素方 差分析(one-way ANOVA)检验，后用Post Hoc Tests最小有意义差 杲t检验(1 east significant difference-t, LSD-t)进行均数间的多重比

27、较。戶 IFN-y蛋白和mRNA表达EA组脾脏T淋巴细胞内IL2和IFNy蛋白表达,与Control组比较没 有明显改变；手术创伤后脾脏IL2利FNy蛋口含量明显降低，Trauma 组与Control组比较有显著性差异(P 0.001; Fig. 1A)；创伤后给予 电针处理后IL-2和IFN*蛋白含量明显增加，T + EA组与Trauma组比 较有明显差异(P = 0.002; Fig.lA)。EA组脾脏丁淋巴细胞内IL2和IFNy mRNA表达，与Control组比较 无明显变化；手术创伤后脾脏IL2和IFNy mRNA表达明显降低， Trauma组与Control组比较有明显差异(P 0

28、.001)；创伤后给予电针 处理后增加IL2和IFN* mRNA表达，T + EA组与Trauma组比较有显 著性差异(P = 0.008; Fig. IB)。 IFN-y30ControlEATraumaT + EA IL.2 IFN-y8 4o.o.0 11_ _l1_ 1ControlEATraumaT + EAFig.l创伤后3天大鼠脾脏T淋巴细胞内IL2和IFN-y蛋白表达(2)脾脏T淋巴细胞内ERK1/2、NF-zcB和AP1表达EA组脾脏T淋巴细胞内total-ERKl/2及p-ERKl/2表达，与Control 组比较无明显差异；totalERKl/2在Trauma组和T +

29、EA组也没有显著 性变化，但其磷酸化ERK1/2 (p-ERKl/2)的表达在Trauma组明显降 低，与Control组比较有统计学差异(戶 0.001)；给予电针处理后磷 酸化ERK (p-ERKl/2)的表达明显增加，T + EA组与Trauma组比较 有显著性差异(P 0.001; Fig. 2A)o脾脏丁淋巴细胞内NF-/cB和AP1的DNA连接活性，EA组与Control 组比较，无明显差异;Trauma组比Control组明显降低(P 0.001 )； 与Trauma组相比，T + EA组NFwB和AP-1的DNA连接活性明显降低, 两组间比较有统计学差异(PIFN-y蛋白和mR

30、NA表达降低，同时p-ERK 1/2 NFkB和AP-1 DNA 连接活性也伴随减低，电针刺“足三里”和“阑尾穴能够增加IL-2、IFN-y蛋口和mRNA表达，同时也增加pERKl/2、NF-/cB和AP-1 DNA连接活性，这些结果表明，电针刺在提高创伤后大鼠脾脏T细 胞内IL2、IFN-y表达和ERK 1/2信号通路活性及其下游核转录因子 NF+B、APJ表达上存在内在的机制联系。手术创伤模型是模拟临床外科大手术及腹腔探查术而建立的，能 诱导T细胞及NK细胞活性的显著抑制，可作为一种免疫抑制模型可 以被用来探讨术后免疫调节机制。术后3天大鼠脾脏T淋巴细胞增殖能 力最弱，IL2活力和含量最低

31、，表明免疫抑制最明显出现在术后3天。 因此，本实验仅选择单个时间点（术后3天）来研究电针刺的免疫调 节功能及其信号转导机制。研究证实，外科手术能广泛抑制机体多种免疫功能，包括对T淋 巴细胞、巨噬细胞的影响和细胞因子的产生。这充分表明手术改变多 种免疫系统功能。实验观察到，创伤大鼠淋巴细胞转化功能、IL-2 诱生活性降低，这表明手术创伤抑制免疫细胞因子产生8o IL-2对维 持免疫功能起着重要作用。创伤后IL2诱生活性降低将直接导致机体 细胞免疫功能的下降9oIFN-y是另外一个介导细胞免疫功能的关键因 子。在手术创伤后，大鼠脾脏T细胞中IL-2蛋白和mRNA表达明显降 低，最低水平出现在术后3

32、天10J1o脾脏组织中IFN*蛋口和mRNA表 达在创伤后也出现降低趋势1233o我们的实验结果也有同样表明， 在手术创伤后3天，大鼠脾脏T细胞内IL-2、IFN-y蛋白和mRNA的表达 明显降低。动物实验表明，电针刺“足三里和“阑尾穴能明显改善创伤诱导 的免疫抑制14 ，4o对大鼠手术创伤模型的观察指出，在相当于人体 “足三里”穴部位，每日予以电针刺激，可以提高创伤机体IL2活性水 平，改善免疫抑制状态，促进创伤机体免疫功能的恢复6o Yuet al15J6J 报道针刺“足三里”穴可显著提高脾组织H4FN-Y水平。本实验结果也 进一步证实，手术创伤导致免疫功能降低的大鼠，予以电针刺可通过 提

33、高脾T细胞内IL2利FN-丫的含量，激活其免疫功能。为了阐明电针刺对细胞因了基因表达的调控机制，我们进一步探 讨ERK1/2信号通路在这一过程中的作用。MAPK信号通路磷酸化后 一个主耍的结果就是使MAPK信号通路下游的核转录因子（如NFwB 和AP1）活化。然后NFkB和AP-1调节参与免疫和炎症反应的各种基 因表达1718o持久激活的ERK可部分转入核内，在核内聚集后，使相 应的转录因子磷酸化，通过Elkl活化AP1组成元件cFos、Fra-1和 Fra-2 DNA连接活性彳。】及nFkB家族的c-Rel核转位，以此來上调 IL2的表达。实验表明，创伤岀血后ERK1/2信号通路活性降低，N

34、F-/cB 和AP-1 DNA连接活性也受到抑制0忑。本实验结果表明，在手术创 伤后3天，大鼠脾T细胞内ERK1/2活性降低，NFkB和AP1 DNA连 接活性也降低，予以电针治疗后ERK信号通路活性有所提高，NF-kB 和AP-1 DNA连接活性也显著增加。这些新的发现提示我们，ERK1/2 信号通路可能是电针刺发挥免疫调节作用的分子机制之一。总之，电针刺“足三里和“阑尾，穴可以提高创伤大鼠脾脏T细胞内 IL2、IFN-y蛋白和mRNA表达，改善术后免疫抑制状态。这种保护作 用与捉高ERK1/2、NF-kB和AP1活性密切相关。这一发现对于理解 电针刺免疫调节机制和临床应用具有重要意义。参考

35、文献Wang J, Wang YQ, Yu J, Cao XD, Wu GC. Electroacupuncture suppresses surgical trauma stress-induced lymphocyte apoptosis in rats. Neuroscience Letters 2005; 383:68-72.Wang X, Tournier C. Regulation of cellular functions by the ERK5 signalling pathway. Cell Signal 2006;18(6):753-60.Zhang YL, Dong C.

36、 MAPK inases in immune responses. Cell Mol Immunol 2005; 2(l):20-7.李绍康，沈瑞珍.用国产尼龙毛纤维分离小鼠T淋巴细胞及T细胞 鉴定上海免疫学杂志1981;1(1):10Zhao H, Huang HW, Wu GC, Cao XD. Effect of orphanin FQ on interleukin-1 beta mRNA transcripts in the rat CNS Neuroscience 2002;114:1019-31.Cheng XD, Jiang JW, Wu GC, Cao XD, He Q乙 Dy

37、namic observation on regulation of electroacupuncture on induction of IL2 production of spleen lymphocytes from traumatized rats. Acupuncture reaserch 1997;105:95.Wang J, Sun J, Yu J. Sympathetic nervous system mediates surgical trauma stress-induced splenocyte apoptosis in rats. European Journal of

38、 Pharmacology 2007;565:76-82.Mehigan BJ, Hartley JE, Drew PJ, Saleh A, Dore PC, Lee PW, et al. Changes in T cell subsets, interleukin-6 and C-reactive protein after laparoscopic and open colorectal resection for malignancy. Surg Endosc 2001;15:1289-93.黄颖苏，姜建伟，吴根诚，曹小定.褪黑素和电针对创伤大鼠淋巴 细胞转化功能、IL2活性及ACTH水

39、平的影响针刺研究2003; 28:42-7.Luo Y, Liang H, Hu C, Xu X, Wang Z. Relations of transcription expression of IL-2 with nuclear factor of activated T cells as well as changes of C-Fos and C-Jun after trauma. Chin J Traumatol 2002; 5:275-8.Liang H, Wang Z, Zhu P. The suppression of T cell functions and its rela

40、tionship with the change of signal transduction after trauma. Chin Med J (Engl) 1999;79:525-8.Suzuki T, Yu HP, Hsieh YC. Mitogen activated protein kinase (MAPK) mediates non-genomic pathway of estrogen on T cell cytokine production following trauma hemorrhage. Cytokine 2008;42:32&Hauser CJ, Lagoo S,

41、 Lagoo A, Hale E, Hardy KJ, Barber WH, Bass JD, Poole GV. Human peripheral mononuclear cells do not show proinflammatory patterns of cytokine transcription in early trauma: a preliminary report. Shock 1995;4:24 7-50.黄颖苏，姜建伟，吴根诚，曹小定.褪黑素和电针对创伤大鼠免 疫功能的影响针刺研究2001;26:233-4.Yu Y，Kasahara T, Sata T, Guo SY, Liu YA, Sano KA, Hisamitsu T. Enhancement of splaenic interferon-gamma, interlenkin-2, and NK cytotoxity by S36 acupoint, acupuncture in F344 rats. Jpn J Physicol 1997;47:173-8 Yu Y, Kasahar