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文档简介
1、关于实验八亲和层析分离纯化蛋白质第1页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三 实验目的掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法(第一部分)掌握SDS检测目标蛋白原理和方法(第二部分)第2页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白第3页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三 一、实验原理第4页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三亲和层析 生物大分子与配体特异非共价可逆结合。酶-底物或底物类似物抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补核苷酸序列(Ol
2、igo-dT)第5页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三亲和层析原理第6页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三GST亲合层析 谷胱甘肽硫转移酶(GST,26kd,与谷胱甘肽GSH特异结合)GSH作为配体,共价结合在葡聚糖上,(Sepharose 4B)GST融合目标蛋白葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合用还原型GSH洗脱GST融合蛋白第7页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三GSH- Sepharose 4B第8页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三GSH- Sepharose 4B第9页,共34页,2022年,
3、5月20日,22点11分,星期三第10页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三第11页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三外源蛋白的表达和纯化第12页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三 二、实验步骤第13页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三第14页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三 (一)目标蛋白诱导表达和菌体收集 10.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白表达,28,200 rpm培养3-6 h。25000 rpm离心5 min,倒掉上清。3沉淀加40 ml水,5000 rpm离
4、心5 min。第15页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三(二)细胞破碎1倒掉上清,加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。2破碎菌体,超声波2 min,停止1 min。 (菌液始终保持在冰浴中)3重复8-10遍,直至菌液清澈。第16页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三(三)离心1每个小组分取1-2 ml细胞破碎液, 12000 rpm,离心5 min。2分取50 uL上清液,4保存。3其余的上清液准备过GST柱子。第17页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三(四)装GST柱子1清洗和装好层析柱,封闭出口。2加入2 mL PBS。3用滴
5、管取0.5-1 ml GST填料,加入柱子中。4打开柱子出口,使PBS缓慢流出。注意:始终保持柱内的液面高于GST树脂。第18页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三(五)纯化目的蛋白1用5 ml PBS缓冲液洗柱床,重复3遍。2将混合蛋白质溶液加到柱子中。3用5 ml PBS缓冲液洗柱子,重复3遍。4加入1ml 洗脱液。第19页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三5用离心管收集洗脱液,每管收集0.2ml。6PBS 缓冲液洗柱子3遍,关闭出口。7用分光光度计测定每一管的吸光度值, 记录读数,绘制洗脱曲线。8将读数最大的一管用于SDS分析。第20页,共34页
6、,2022年,5月20日,22点11分,星期三第二部分SDS检测目标蛋白第21页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三 一、实验原理第22页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物,消除了蛋白质间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200 KD之间,迁移率和分子量的对数呈线性关系:log MW = K - bm第23页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三第24页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三浓缩胶浓缩胶pH6.8,Gly pI6.0,三类离子在电场中的迁
7、移速度:Cl-蛋白质Gly-。电泳时,Cl-快,Gly-慢,在快慢离子间形成了一个低离子浓度的高压区,区内的蛋白质加速移动。当蛋白质移到Cl-区时,高电压消失,蛋白质的移动速度减慢,在快慢离子间被浓缩。第25页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三二、实验步骤1洗净玻璃板,用蒸馏水冲洗干净后吹干,安装制胶器。2根据下列配方制作12%分离胶。 第26页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三12%分离胶试剂名称12%分离胶蒸馏水2.5 ml30% 丙烯酰胺(29:1)3.0 ml1.5M Tris-HCl(pH8.8)2.0 ml10% SDS75 ul四甲基乙
8、二铵(TEMED)10 ul10% 过硫酸铵(AP)75 ul总体积7.5 ml第27页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三按上表中所列顺序加试剂,加完AP后轻轻摇匀,迅速加入两块玻璃板间。在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水,聚合15 min,至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线,倒掉水层,用滤纸条吸干残余的水。第28页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三试剂名称5.0%蒸馏水1.7 ml30%丙烯酰胺(29:1)430 ul1M Tris-HCl(pH6.8)310 ul10%SDS25 ul四甲基乙二铵(TEMED)10 ul10%过硫酸铵(AP)
9、25 ul总体积2.5 ml3制作5.0%浓缩胶 按照下表配好浓缩胶,轻轻混匀,灌胶2ml,插入梳子,聚合15 min。第29页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三4把胶板放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,拔掉梳子,电极缓冲液应该完全没过电极。5每个点样孔加30ul样品,每板胶加10ul Marker。650V电泳20min,等蛋白进入分离胶后,将电压调节到80V,电泳2-3h。7等到溴酚蓝接近胶底部时,关闭电源。第30页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三8撬开玻璃板,将凝胶放在塑料盒内, 加入染色液,染色30min。9染色后的凝胶用蒸馏水漂洗,用脱色液脱色。(或用蒸馏水加热脱色)第31页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化非诱导诱导纯化1 纯化2 Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37,OD=0.8,0.5mmol/L,IPTG,28 ,200rpm,6h第32页,共34页,2022年,5月20日,22点11分,星期三SDS样品制备 1号样,过亲和层
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