等温滴定量热法

1、等温滴定量热技术摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。 生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。相互作用过 程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。等温滴定量热技术（ Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已 经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、 准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力 学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合（

2、A H）、熵（$）、恒压热容（ Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。这些信息提供了生物分子相互作用的真 实写照。由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可 以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制 剂相互作用、酶促反应动力学、药物DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作 用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期1。从 此这种技术被广泛应用。在过去

3、的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用 的常用方法。随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用。分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础。生物分子识别过程需要结合反应的热 力学参数来阐明。等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定 反应的结合常数Kb、结合计量比（n）、反应焓变（AH）、熵变QS）、恒压热容（ACp） 和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作 用。ITC已成为研究生物大分子结合反应的有力工具。现代的ITC仪器可以测量0.1 u cal （0.4 nJ）的热效应，108 - 109M-1

4、的结合常数，反应速率可以精确至10-12 mol/s，Km和kcat的测 量范围分别在10-2 - 103mM和0.05-500s2。由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化， ITC的应用非常广泛，包括涉及焓变的化学和生化结合反应以及一些复杂过程，比如酶动 力学。与其他的研究方法相比，ITC不需要作任何的化学修饰或固定，可以直接地测量结 合焓。许多生化反应可以在等温条件下完成，通过滴定改变样品的组成，为ITC提供了广 阔的潜在应用前景。它对于阐明分子结合机制，结合分子结构进行药物设计等都有重要的作 用。等温滴定量热技术简介ITC是一种热量连续变化的量热器。主要由隔热夹套包裹着的样品池（反应池）

5、和参比池、 注射器和一台计算机组成，注射器同时具有搅拌作用，计算机控制温度控制装置和信息反馈 系统（图1） 3。恒温条件下当滴定进行前，首先反馈系统给样品池一个连续的能量确定基 线。滴定进行时，注射器滴入反应物（通常是用小分子物质滴定大分子，本文中注射器中的 反应物称作配体，ligand，L）与样品池中被滴定物（本文中被滴定的反应物称作大分子， macromolecule，M）相互作用触发结合反应，形成大分子/配体复合物（macromolecule/ligand， ML）。复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在 实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池

6、的温度变化，每注射一次后系统恢复至 平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。随着池中反应趋于饱和，热量信号逐渐减弱知道只看到背景热 量(图 2)2。图 1 ITC 结构示意图(2004, Current Protocols in Cell Biology)样品池和参比池由隔热夹套包裹，注射器将滴定物注射入样品池，同时作为搅拌器，计算机 控制温度控制装置和信息反馈系统。图 2 ITC 的热量补偿系统(Matthew W. Freyer and Edwin A. Lewis， 2008)典型的ITC数据如图3,每次配体滴定入反应池中

7、对应着一个峰，记录的信号是保持样 品池与参比池温度恒定需要添加或移除的热量，图3表示的是一个吸热反应。每个注射峰上 面对应的面积积分与每次注射吸收的热量相当。将得到的数据用软件（通常用origin软件） 与合适的模型进行拟合，就能得到相应的热力学参数：结合常数K、结合焓变AH、化学计 B量数n2。在实验温度下，有了这些热力学数据就可以根据以下两个公式充分阐明反应中的 热力学变化：AG = -RT ln KB ；AG = AH -TAS；另一个重要的热力学参数恒压热容（Cp）也可以通过测量一系列温度下AH的变化获 得：ACp = dAH/dT。2-02-432 一1 -0 -V1PTV01234

8、（Liga ndy m acrom olecule-图 3 典型的 ITC 数据（2004, Current Protocols in Cell Biology）ITC操作流程ITC实验主要包括以下步骤：（i）确定合适的反应物浓度，（ii）准备样品，（iii）滴定，收集 数据，（iv）校正原始数据，（V）校正后的数据非线性回归得出热力学参数，（vi）分析模型。 下面详细介绍每个步骤：（i）为了确保结合反应中热量的变化在ITC的测量范围之内首先要确定合适的反应物浓度。 通常反应物的浓度在微克级，但是如果反应过程中热量变化很明显，可以适量降低反应物浓 度。结合曲线的形状取决于结合常数KB和被滴定的

9、大分子的摩尔浓度Mt1:c=kbmt受C的影响的等温线的形状对结合常数起决定向作用，当C值高时（500），等温线的 形状几乎成直角，而且受kb的影响较小，当C值较低时，等温线趋平，不能输出有效的 KB （图4）4。实验过程中为了精确测定KB最好使C值在10-100的范围之内。因此，当结 合能力较强时（107-108M-1），需要低浓度的大分子反应物。当结合能力不强时，可以适当增 加大分子反应物的浓度来获得较好的结合等温线。-10-11 -CJ-10-11 -CJC一oOuv-Etj工02Molar Ratio图4 等温线的形状受结合常数KB和大分子摩尔浓度Mt影响的曲线(2004, Remo

10、Perozzo,Gerd Folkers,and Leonardo Scapozza)在特定的滴定次数下为了获得完整的结合等温线，注射器中的配体的浓度应该比反应池 中大分子的浓度高。这样滴定结束时，反应池中配体和大分子的摩尔比大约为2-3(对于1:1 的化学计量数)。通常注射器中配体的浓度时反应池中大分子浓度的10-20倍。每次连续的注射之间的时间也是非常重要的。如果结合非常迅速，基线很快会达到平衡 状态，一般滴定后3-4min足够恢复平衡。相反，如果热量的变化是一个非常缓慢的过程， 就需要较长的时间恢复热平衡。选择合适的反应条件需要考虑反应物的溶解性、稳定性和反应系统的生物学因素。反 应物溶

11、液的缓冲液类型、缓冲液浓度、PH、盐浓度和共溶剂必须相同。反应器和注射器中 缓冲液组分相同可以避免稀释热等非特异性的热效应影响实验结果的质量和热力学参数。解 决这一问题最好的方法是将大分子在所需用的缓冲液中进行透析，配体用缓冲液直接溶解。 此外，在疏水的反应物中可以加入适量的DMSO也会有利于ITC信号，但要保证注射器和 反应池中DMSO的浓度相同。在配制反应物溶液时要避免产生气泡。注射器中的气泡会影响注射体积并产生额外的热 信号，反应池中的气泡会干扰反应池壁感应溶液的热量变化。所以在实验之前样品要进行抽 气处理。根据实验需要准备适量体积的样品。实验过程中测定的是配体滴入后样品池壁感受到的所有

12、热量变化(Qmeas)，其中包括 了非特异性的热效应，如配体滴入后的稀释热、大分子的稀释热、搅拌热、样品池和注射器 的热量差、缓冲液组分微小的差异。所以为了精确测量复合物形成时的热效应，除了设计的 滴定实验外，我们必须至少要做另外三个空白滴定实验一一配体滴缓冲液Qdil.ligand)、缓冲 液滴大分子溶液(Qdiyacromolecule)、缓冲液滴缓冲液(Qblank)。开始滴定之前，要用抽过气的水和缓冲液清洗注射器和样品池，然后除去所有溶液， 干燥。然后将大分子溶液注入样品池中，注射器中吸入配体溶液，整个过程中都要避免产生 气泡。设定仪器程序一一注射次数、反应温度、参比功率、起始延迟、配

13、体浓度、大分子浓 度、搅拌速度、注射体积、注射持续的时间、注射间隔时间、第一滴的注射体积(W3ul，一般不计入数据分析）。一切准备就绪后，首先建立基线，当基线平稳没有大的噪音和漂移时开始滴定，三个 空白滴定的程序必须和样品滴定程序相同。然后收集原始实验数据。实验结束后清洗、干燥ITC.（iv）通常透析基本上已消除了搅拌和稀释热，但有时配体自身的稀释热不可忽略。严格起 见，三个空白滴定实验的误差都要去除，得到校正后的热量（Qcorr）。Qcorr =Qmeas - Qdil;ligand - Qdil;macromolecule - Qblank （V）分析ITC数据获得相关的热力学数据就要确定

14、一个合适的结合反应模型。就是用数学 方法描述量热计内的生化过程，用非线性回归确定最适模型。但是所有的模型都不是生化过 程正确的模拟，但是它可以帮助我们理解实际的生化过程2。非线性回归时一个非常复杂 的过程。首先要估计模型方程中每一个参数，根据这些估计值，会根据实际数据曲线产生一 个理论曲线，误差函数会计算出实际和理论曲线间的面积偏差，然后用公认的算法改变各参 数使计算出的曲线更贴近实际曲线，这个过程会一遍遍重复，直到误差缩小到最小。如果误 差不能在可接受的范围之内，就要试另一种模型。目前非线性回归的这些过程都可以用计算 机软件（Origin）完成。同时相关的热力学参数n、AH、AS. KB也会

15、给出（图5）。E.330060 00Time (min)2 oE是.EwJEJwm-HE0.00E.330060 00Time (min)2 oE是.EwJEJwm-HE0.00图5原始的ITC数据和数据整合后的模型（2004, Remo Perozzo,Gerd Folkers,and LeonardoScapozza）（vi）正确理解反应过程首先要理解模型给出的各参数的正确意义。根据模型给出的各种热 力学参数确定反应的相关性质。结合位点数不同，平衡常数和物料平衡的表达公式是不同的（图6）。单结合位点：K =（1-）L双结合位点：,0|p0 -O1）-L and A（i-Ml多结合位点：K

16、K FL： A. _ 一叩一 LPL 】/ PLi乙=L - ：PL + 2：PL?| -3PU：(ollyB呈)工1Mol atio(ollyB呈)工1Mol atio图6 两个配体分子与大分子结合可能的三种模型(2004, Remo Perozzo,Gerd Folkers,andLeonardo Scapozza)应用实例随着ITC仪器的发展，ITC得到了广泛的应用，大量的学术研究中用到ITC技术，仅2007年就有大约600篇出版物报道了相关的ITC数据5, ITC已经应用于以下方面(1)蛋 白质-蛋白质，（ii）蛋白质-多肽，结构未知的多肽与蛋白质相互作用，（iii）蛋白质/多肽-配

17、体（糖类、co-factor、药物、洗涤剂、脂肪酸等），（iv）蛋白质/多肽-金属离子，（v）蛋白质 /多肽-核酸，（vi）蛋白质/多肽-脂质，（vii）蛋白质/多肽-多聚物，（viii）核酸-小配体（如药 物），（ix）酶活和酶动力学等方面5。这些应用对于阐明分子的作用机制和进行推理药物设 计等都有重要作用。下面介绍一下根据HIV-1天冬氨酸蛋白酶结构进行的药物设计，HIV-1天冬氨酸蛋白酶 对于HIV病毒的加工过程具有重要作用。图7表明的是Ac-pepstatin和KNI764两种蛋白 酶抑制剂分别与HIV-1蛋白酶的结合能力以及KNI764与Ac-pepstatin竞争蛋白酶的结合位 点

18、的情况。KNI764与蛋白酶的结合能力很强，结合常数已超出了量热计的测量范围。Ac-pepstatin与蛋白酶的结合能力较弱，结合常数为KB1 =2.4x106 M-i。在竞争滴定试验中， 结合能力较强的抑制剂可以竞争弱抑制剂的结合位点得到竞争结合常数 kB2，根据公式 KB2=KB3/（1+KB1）可以得到KNI764与蛋白酶的结合常数KB3 = 3.1x1010 M-1。图 7 HIV-1 蛋白酶抑制剂的竞争滴定（2001, Velazquez-Campoy A, Kiso Y, Freire EITC的优缺点随着ITC应用的日益广泛，它的优点也日益明显（i）它不干扰蛋白质和核酸的生理功

19、能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学 性质等没有任何限制条件。（ii）方法灵敏度高，可测的亲和力范围从102到1012/M都可以 实现，测量时不需要制成透明清澈的溶液。（iii）量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进 行后续生化分析。（iv）微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此 这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律。美中不足的是，每个ITC滴定实验至少需要30-60min，还不能快速高通量的进行实验。 展望ITC是目前唯一能够测量生物分子相互作用中热量变化的技术，ITC的技术优势使它得 到

20、了越来越广泛的应用。最新ITC技术的发展主要集中在改进样品的通量，这样就可以进行 大量的药物筛选。另一个发展方向就是降低实验需要的样品量，用较少的样品进行微量热滴 定。随着ITC技术和设备的不断更新和改进，ITC在未来的药物设计和分子作用机制研究等 方面会发挥更重要的作用。参考文献：T. Wiseman, S. Williston, J.F. Brandts, L.N. Lin, Anal. Biochem. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter

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