HGH质量检定实验

1、产品质量研究对于rHGH产品的质量研究贯穿整个实验室研究、中试研究过程，并对工艺各阶段进行严格的质量控制，确保产品的高质量。对中试产品的质量控制分两方面进行：1. 半成品/成品的质量控制；2. 成品的质量控制。均严格按照中国生物制品检定规程（2000版）中各相关规定与程序进行。一产品质量研究半成品质量检定1.1免疫印迹试验： 用鼠抗人的HGH单克隆抗体（Neomarkers公司）对rHGH进行western blot分析。结果见图1，rHGH显示强阳性。m 1 2 3 1 2 3m 1 2 3 1 2 397kd66 kd43 kd31 k97kd66 kd43 kd31 kd20 kd14

2、kd(a) (b) 图1. rHGH表达SDS及western-blotting图（a）：SDS胶 （b）：Western blotting膜M: Marker ；1.2.3 HGH原液冻干品1.2紫外光谱扫描：根据中国生物制品检定规程（2000版）中“紫外光谱测定”的具体方法进行。将纯化样品用生理盐水稀释到0.5mg/ml，加入1cm石英吸收池内，在220-300nm波长范围内扫描样品。图21 批号rHGH扫描图图22: 20020902批号rHGH半成品扫描图同时还扫描另外2个批号半成品，特征波长如下：样品特征峰波长nm吸光值200209012790.42417200209022790.4

3、1222200209032790.43200可见，本产品蛋白质特征峰在2773nm范围内1.3 纯度及分子量检测a. sds电泳：用非还原型SDS法检测样品的纯度，还原型SDS法检测样品的分子量，将待检样品加上样品缓冲液，加热5分钟，上样，使加样量不低于5g（银染法）或10g（考马氏亮蓝R-250染色法），经Pharmacia vds扫描分析。 a b c a b c a b c图31.半成品还原、非还原SDS电泳Marker 2012011批号rHGH还原处理 2012011批号rHGH非还原处理b . 2012012批号rHGH还原处理c 2012012批号rHGH非还原处理b 20120

4、17批号rHGH还原处理c 2012017批号rHGH非还原处理扫描结果如下： 样品名称主带扫描面积分子量(Da)2012101198.5220152012101297.922204 2012101799.522125 可见，半成品迁移位置一致，连续3批半成品扫描纯度达到95%以上，连续3批半成品分子量为22125205.92，说明用非还原电泳检测蛋白纯度和用还原电泳检测蛋白分子量方法可信。b. 分子量检测：（质谱法）使用对照品（Saizen HGH），加250l无菌PBS溶解成100g/ml，10ul分装。将对照品与样品做质谱检测，分子量均为22 125D。图32对照品质谱图图33 批号20

5、031027样品质谱图c. HPLC纯度分析：在方法建立之时，我们采用Saizen HGH对照品做对照，同时以原液缓冲体系做基线。具体方法如下：色谱条件色谱主机厂家与型号：Waters 600 486色谱柱厂家与规格：Waters C18 3.9300mm 流动相：A: 10乙氰+0.1TFA B: 乙氰0.1TFA梯度：timeflowA%B%0110002512080301208033101003511000流速：1.0 ml/min样品上样浓度：标示量为0.5mg/瓶，加纯化水溶解成1mg/ml样品上样量：20ul检测波长：280nm结果如图：样品纯度97HGH标准品HPLC图谱Name

6、Retention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeak TypePeak Codes122.0381254590100.0055204BBUnknownHGH原液冻干品 HPLC图谱NameRetention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeakType Peak Codes117.872171790.70453BBUnknown220.04969661.09275BBUnknown321.61769901.301382BVUnknownI06 422.07759170797.0025451V

7、BUnknown同时研究其它2个批号半成品，其保留时间、主峰面积如下： 样品名称保留时间主峰面积标准品22.0381002003101722.07797.002002090222.04597.122002090322.05698.20可见，对照品与样品的主峰时间大致相同，半成品纯度为97-100，本实验方法可以用于HGH纯度测定。1.4 等电点测定：根据中国生物制品检定规程（2000版）中“等电点测定”的第二法“等电聚焦水平板电泳”具体方法进行。半成品用7000D截流量的透析袋在纯化水中，4透析过夜，lowry法定量，随后稀释到0.5mg/ml 浓度，两性电解质为pharmacia公司pH3.

8、0-10.0，上样量10l。硫酸铜考马斯兰染色。HGH pI为5.2（4.0-6.5）. 1 2 2rhGH3.504.555.205.856.556.857.358.158.458.659.3 rhGH3.504.555.205.856.556.857.358.158.458.659.3 r hGH原液等电聚焦图1PI Marker: 从上到下PI依次为3.50、4.55、5.20、5.85、6.55、6.85、7.35、8.15、8.45、8.65、9.302原液扫描后结果如下：样品PI200310175.2200310185.2可见，各批样品在等电聚焦电泳中的迁移位置一致，PI一致，说明

9、用此方法测定HGH等电点方法可信；本产品的等电点在4.0- 6.5范围内。1.4 相关蛋白含量测定：根据药典，取系统适用性试验用溶液20ul (取重组人生长激素对照品或甲酰化重组人生长激素对照品，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(ph 7.5)制成2mg/ml，加过氧化氢溶液使终浓度为0.01ml/ml),4放置5小时后，每1 ml加入4.5mg 的L-甲硫氨酸），注入HPLC。色谱主机：Waters 600 Waters TM486 MILLENNIUM32色谱柱：5um, 4.6mm*150mm C4分析柱流动相 A：0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（PH7.5）流动相 B：正丙醇

10、 色谱纯(Fisher A-414-4)梯度： timeflowB%A%00.50100200.52971500.58020流速：0.5ml/min样品浓度： 1mg/ml样品上样量： 20ul检测波长：220nmHGH发酵液HPLC图谱NameRetention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeak Type Peak Codes1 0.304 2509589 0.72 289171BV Unknown20.621104347633.00613877VVUnknown30.976170897994.92682987VVUnknown41.49

11、4113000803.25644123VVUnknown51.719182603585.261003383VVUnknown61.900136836193.94828503VBUnknownI06 712.25016123150.4610530BBUnknownI08 819.699107764473.10121714BVUnknown919.9008242270.24119585VVUnknownI06 1020.92374027782.13161335VVUnknown1122.415239781006.90308462VVUnknown1222.63353008491.53303552V

12、VUnknownI06 1322.996201644515.81289942VVUnknown1424.902172378764.96396934VVUnknown1526.3028502070.2446819VVUnknown1626.86320860400.6055520VVUnknown1727.39432412040.93115146VVUnknown1828.16722682720.6576761VVUnknownI08 1928.61836231661.0485065VVUnknown2029.61536276571.0485441VVUnknown2133.34079854908

13、22.99852771VVUnknown2233.8123613777610.40880548VVUnknown2334.40074848072.16530730VVUnknownI06 2434.705148811094.28473269VVUnknown2535.534217658726.27286527VVUnknown2637.40319553450.56100350VVUnknown2737.70359718771.7292508VVUnknown2839.51412170750.3534583VVUnknown2940.31312584710.3640083VVUnknown304

14、0.9003231170.0914087VVUnknownI06 3141.433676860.027620VVUnknownI06 3241.7171268350.046528VBUnknownI08 3343.3671870.0029BBUnknownI08 HGH标准品 HPLC 图谱NameRetention TimeArea% AreaHeightInt TypeAmountUnitsPeakType PeakCodes1Peak133.1186290337579.251594087BVFoundQ20 2Peak234.10748039036.05222709VVFoundQ20

15、3Peak334.50762621157.89173893VVFoundQ20 4Peak435.60551747726.5281626VBFoundQ20 5Peak539.06737860.00148BBFoundI08 Q20 6Peak640.167922650.122176BBFoundI08 Q20 7Peak746.750943140.123475BVFoundI08 Q20 8Peak847.333425170.051919VBFoundI08 Q20 图5 HGH标准品+ H2O2 HPLC 图谱NameRetention TimeArea% AreaHeightInt Ty

16、peAmountUnitsPeak TypePeak Codes1Peak121.33356243266.1746937BBFound I08 Q20 2Peak225.4671515498416.6368691BVFoundI08 Q20 3Peak327.70076518248.4058680VVFoundI08 Q20 4Peak431.5256267740668.78534321VBFoundQ20 5Peak5 37.48329590.00194BVFoundI08Q20 6Peak637.51714030.00184VBFoundI06Q20 7Peak738.0001880.0026BBFoundI08Q20 8Peak838.617181040.02719BVFoundI08Q20 9 Peak939.117498