MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

1、MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌查验方法MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌查验方法3/3MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌查验方法MM_FS_CNJ_0158出口食品蜡样芽孢杆菌微生物法MM_FS_CNJ_0158出口食品中蜡样芽孢杆菌查验方法合用范围本方法合用于出口食品的查验。培育基和仪器培育基甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂；l-酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改进V-P培育基；动力培育基；胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)；Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂；V-P试剂；碱性复红染色液。2.2.仪器吸管

2、：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培育装置；涡动搅拌器；形玻璃棒；恒温培育箱：30及361。样品的保留和送检待检样品应保持在6以下运送并尽可能不使其冷冻。送到实验室后，应保存于4并赶快进行查验。如在4d内不可以进行查验，应将样品积蓄在20，查验前再于室温下解冻。脱水食品可在常温下送检和积蓄。样品的制备4.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。4.2.加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以1800020000r/min均质2min。制成110样品稀释液。4.3.取110稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液

3、的稀释瓶中，充分混匀制成1100的稀释液。4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递加稀释直至106。查验步骤5.1.平板计数法取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。将平板置于30培育24h。采用拥有15150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的均匀菌落数。蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，围绕产生卵磷脂酶积淀环。如反响不典型，可连续培育24h再计数。计数后，从每个平板最少采用5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30培育24h

4、，按第6章进行证明试验。依据证明试验确立为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比率计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，此后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例：将检样104稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行判断，证明为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为(254/5)104102106。5.2.近来似值(MPN)法合用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个/g的食品。采用三管法MPN系列。取101、102、103三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。置于30培育482h。从长菌的试管取培育物划

5、线接种到MYP琼脂平板上。置30培育2448h。从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有积淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30培育24h，供作证明试验。依据证明试验确立为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表附录C(增补件)计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g，并作出报告。证明试验形态察看取营养琼脂斜面培育物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。生化学性状葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35培育24h。培育基应由红色变成黄色(表示本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。硝酸盐复原试验：接种于硝酸盐肉汤中，35培育24h。加硝酸

6、盐试剂后应为阳性反响(红色)。V-P试验：接种于改进V-P培育基中，35培育48h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反响(伊红色)。L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培育基上，35培育48h，阳性反响菌落四周培育基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应连续培育72h再察看。溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，35培育24h。该菌在本培育基(含0.001%的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反响，应连续培育24h。卵磷脂酶试验：接种于MYP琼脂平板上，35培育24h。阳性反响菌落四周应出现积淀环(表示产生卵磷脂酶)。6.3.蜡样芽孢杆菌与近似菌的鉴

7、识试验动力试验：用接种针挑取培育物穿刺接种于动力培育基中，30培育24h。有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌经常呈绒毛状生长，形成所谓的蜂巢状扩散。也可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌平常运动极为开朗，而炭疽杆菌则不运动。根状生长试验：用接种环取培育物接种于营养琼脂平板上，30培育1824h。蜡样芽孢杆菌群的多半菌株形成粗拙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。此中独一蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特点。溶血试验：取培育物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，3032培育24h。蜡样芽孢杆菌落四周表现型完满溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌表现弱的溶血现象，而炭疽芽孢杆菌平常为不溶血。蛋白质结晶毒素试验：取经30培育24h并于室温搁置23d的营养琼脂培育物少量于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再经过分焰干燥，于载片上滴满0.5%碱性复红液，纵火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后连续1.5min，移去火焰，使载片搁置0.5min再倾去染液。用干净自来水完满冲洗、晾干、镜检。察看有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富，应将培育物置室温23d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌群的其余