TCR的研究分析报告

1、word 专业整理TCR 的研究进展一、 概述1、什么是肿瘤？肿瘤（Tumor）是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症（cancer）。2、治疗肿瘤的常规方法纵观传统治疗恶性肿瘤方法，肿瘤外科学、肿瘤放射学、肿瘤化学是现代肿瘤的三大支柱。三种手段各有千秋。外科手术和放射都为局部方法，因为以往外科学家和放射学家对肿瘤的概念及结构的认识极为相似，两者都认为恶性肿瘤发生在局部，侵犯周

2、围组织，经淋巴管、血管或通过自然腔隙转移，它的重点是原发病灶、局部侵犯和区域淋巴结转移。这两种，对大多数早、中期肿瘤是最有效的手段。但对中、晚期恶性肿瘤而言，往往因局部不彻底，残留病灶的复发及远地转移而毙命。当然手术和放疗在技术和措施上有较大差异，手术更能将相对静止细胞及对放疗不敏感的肿瘤，有根治的可能，但受细胞的缺氧程度、肿瘤类型与细胞修复等的因素的影响，对肿瘤局部的控制不如外科手术，但对因解剖部位肿瘤侵犯较为广泛的，特别是临近临近中要结构手术切除困难及亚临床灶的存在，放疗有更大的适应症及灵活性。虽然手术与放疗控制局部肿瘤有效，但对大多数恶性肿瘤而言，一开始就应看作是全身性疾病，大多数需要与

3、化疗结合。肿瘤化疗是一个发展迅速的领域。目前单用化疗即可以至于某些肿瘤如小二急淋等外，许多恶性肿瘤几乎必需有化疗参与才能治愈；对中期恶性肿瘤的术前、术中化疗、术后辅助化疗；对化疗有一定敏感性的肿瘤放疗增敏；手术、放疗后复发转移癌的姑息等应用日渐广泛。但尽管新药不断问世，化疗方法不断进步，但对大多数实体恶性肿瘤而言，因肿瘤对化疗药物的多药耐药、肿瘤的异质性、缺氧细胞的不敏感性等，都很难达到根治的效果。3、现代治疗肿瘤的新发现80 年代的开始的生物，不断推出新疗法，如过继性免疫疗法，细胞因子法，基因疫苗法等等。其中，过继细胞免疫治疗(ACT)在血液系统疾病的临床应用已获得广泛认可，尤其在目前疫苗免

4、疫治疗还存在着不能有效一直微小残留肿瘤生长等多种因素而限制了其临床应用的前提下，ACT 在实体肿瘤治疗中的应用研究也引起了人们的普遍关注。ACT 可通过体外扩增筛选出高活性的免疫效应细胞，将其转入宿主体内并建立长期的特异性抗肿瘤免疫效应，具有良好的应用前景，成为今年来肿瘤免疫治疗中十分活跃的研究领域。图表 1：肿瘤各种疗法的对比图学习资料 整理分享word 专业整理二、 过继细胞免疫治疗（ACT）图表 2：肿瘤生物治疗的发展史在发展的前期，肿瘤过继免疫疗法是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用 IL-2、抗 CD3 单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增，然后转输给肿瘤患者

5、，提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。图表 3：肿瘤过继免疫疗法的图解说明学习资料 整理分享word 专业整理细胞免疫治疗的技术已经发展至第三代，第一代是 CIK 自(体细胞免疫疗法)，第二代是 CA R -T嵌合(抗原受体 T 细胞免疫疗法)，第三代是 T C R -T (特异性 T 细胞受体免疫疗法)。1、CAR-TCAR-T 疗法的核心机制是通过特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应 T 细胞的靶向性、杀伤活性和持久性较常规应用的免疫细胞大幅提高，从而打破宿主免疫耐受状态，克服免疫逃逸，最终杀灭肿瘤细胞。CAR 结构自 1989 年起，不断改进，目前为止已发展到第 4 代。第 1

6、 代 CAR 信号肽只有 TCR/CD3链或免疫球蛋白 Fc 受体 FcRI链单一信号分子，虽能识别靶抗原并靶向激活 T 细胞，但由于缺乏协同刺激分子不能充分激活 T 细胞，而且活化的 T 细胞在体内存在时间短。学习资料 整理分享word 专业整理2 代 CAR 信号肽添加了一个协同刺激分子，能够更好的为 CAR-T 细胞提供活化信号，这样 CAR 识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高 T 细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。3 代 CAR 信号肽区整合 2 个以上的协同刺激分子，可使 T 细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞作用。4 代 CAR

7、 除了嵌合抗原受体基因外，增加了一个或多个可以编码 CAR 及其启动子的载体，该载体可通过某些细胞因子如 IL-2 成功激活 CAR 的信号通路。图表 4：CAR-T 免疫疗法的图解说明2、TCR-T与 CAR-T 疗法不同，TCR-T 的优势在于增强或重建患者的抗肿瘤免疫的同时副作用较少。TCR-T 的核心机制是筛选获得了反应性 T 细胞克隆，继而见到了可特异性识别肿瘤抗原的 T 细胞受体基因，再将编码肿瘤特异性 TCR 的基因导入成熟 T 细胞，获得的 TCR 基因修饰 T 细胞可在体外特异性识别抗原阳性肿瘤细胞，并在回输患者体内候建立抗肿瘤免疫。它也包含 3 大方向：a、通过肿瘤特异性

8、TCR 转染 T 细胞赋予其肿瘤识别功能：通过对癌症特异性的基因赋予 T 细胞抗原识别特异性，使其有效识别杀伤肿瘤细胞。b、肿瘤特异性 TCR 基因转染 T 细胞活化诱导记忆性 T 细胞分化：研究肿瘤特异性 TCR 基因转染 T 细胞被肿瘤抗原充分激活后，记忆性 T 细胞的分化情况，并明确其表型和肿瘤反应性，为进一步获得 TCR 基因转染记忆性 T 细胞奠定基础。c、肿瘤特异性 TCR 基因转染纯化候中枢型记忆 T 细胞（Tcm）：由于记忆性 T 细胞的抗肿瘤免疫能力和体内生存能力都强于混合成分的 CD8+T 细胞。而 T 细胞的内在性质决定了其回输体内后的生存能力和长期免疫功能。学习资料 整

9、理分享word 专业整理3、源于 IPSc 的新“T 细胞”疗法IPSc 细胞技术应用于一类免疫杀伤 T 细胞的建立 T-IPSc 细胞。这些 T-IPSc 细胞使用的是患者自身产生的 T 细胞和 T 细胞由其衍生的功能靶向特定病毒。自杀基因iCaspase9（IC9）引入 T-IPSc 细胞，然后再分化成杀手 T 细胞能够攻击只有特定的病毒。三、现今国内外主流药企在免疫治疗的布局近几年，癌症的免疫疗法研究成为癌症研究领域的热点，吸引了众多投资者的目光，也获得了制药企业的关注，全球著名的跨国制药企业如阿斯利康、辉瑞、葛兰素史克等纷纷涉足癌症免疫疗法，与生物技术合作是主要的途径。学习资料 整理分

10、享word 专业整理图表 5：主要跨国制药企业投资免疫疗法免疫疗法预知的优势使其成为跨国制药巨头的追逐对象，另外，率先布局空白市场获得竞争优势也是各大制药巨头投资“不差钱”的主要原因。虽然相较于其他的药品市场，抗肿瘤药的市场竞争相对缓和，但随着专利到期、仿制药市场快速发展等的情况下，各制药企业还是感觉到了一定的竞争压力，尤其是对动辄单个药品销售几十亿美元的抗肿瘤药物行业来说，根据前瞻产业研究院发布的2015-2020 年中国抗肿瘤药物行业市场前瞻与投资战略规划分析报告显示，2013 年全球肿瘤药物销售 TOP20 中，有 3 个产品的销售规模超过 60 亿美元，7 个产品的销售规模在 25 亿

11、元以上，18 个产品的销售规模超过 10 亿元。可见对于抗肿瘤药物生产企业来说，时间即是金钱。学习资料 整理分享word 专业整理图表 6：2013 年全球肿瘤药 TOP20（单位：亿美元）学习资料 整理分享word 专业整理图表 7：国内细胞治疗布局对于未来企业的竞争趋势，前瞻产业研究院认为，未来全球抗肿瘤药物行业市场竞争会加剧，但寡头垄断的竞争格局不会发生太大的变化。随着肿瘤疾病越来越成为威胁全球健康的一大杀手，各主要的制药企业均看好肿瘤药物市场前景，在肿瘤药物研发投入上也毫不吝惜，从肿瘤药物研发投入占到新药研发 40%-50%的比例即可看出。随着越来越多的企业加入市场争夺中，必将带来市场

12、竞争的加剧，但是，按照目前各主要行业巨头的投入和后备产品储备等情况来看，短期内，罗氏、诺华、赛诺菲、辉瑞等行业巨头的垄断地位不会受到大的动摇。国外肿瘤免疫治疗产业以免疫治疗药物为主，而我国肿瘤免疫治疗产业主要包括三个部分，免疫细胞存储、肿瘤免疫治疗药物、细胞免疫疗法，其中以细胞免疫疗法为主。免疫系统是人体自身的医生，而肿瘤免疫治疗被认为是唯一有可能彻底治愈癌症的方法，目前肿瘤免疫治疗多数被用于晚期癌症患者，但将来可能会像化疗一样，成为癌症治疗的一线方法。预计到 2025 年有 100-150 亿美元的市场只是个开始，未来 10 年 60%的癌症病人将采用免疫治疗，在美国达 350 亿美元。就国

13、内而言，专家估计三年内将达到几百亿的市场规模。国内能够开展肿瘤免疫的医疗机构及潜在对象包括：1）已经开展业务的 500 多家三甲医院，现有技术和管理不成熟，新技术代替可能性较大；2）尚未开展细胞治疗的 500 多家三甲医院，其中大部分可以推广；3）有条件的三乙、二甲等医疗机构；4）体检中心及高端会所，不属于医疗行为的亚健康人群保健，利润空间更大。如按三甲医院，一家医院每月收 30 个病人、每个病人治疗 3 个疗程、3 万/疗程计算（目前市场的评价情况和常规收费），单三甲医院近几年保守估计就能达到 300 多亿的市场规模。学习资料 整理分享word 专业整理四、TCR 修饰的 T 细胞疗法传统的

14、特异性过继免疫治疗主要通过手术获得患者新鲜肿瘤组织，分离其中的肿瘤浸润性淋巴细胞单克隆扩大培养而得到的，或者通过自体和异基因抗原体外诱导患者自身外周血、淋巴结或脾脏中的淋巴细胞生成。但由于目前手段获取特异性 t 细胞的效率太低，操作过于复杂，扩增难、时间长且有限，因此往往达不到预期治疗效果。T 细胞受体(T cell receptor，TCR)是 T 细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的效应分子，是人类基因组中多态性最高的区域之一，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。近十年来，有学者相继分离到抗原特异 TCR 基因并将其转导至初始 T 细胞中，使该 T 细胞表达外源 TCR 并获得特异性识

15、别抗原的能力，能够识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，通过这一方法，可短期内获得大量抗原特异性 T 细胞，使得 T 细胞过继性免疫治疗有了新途径。 T 细胞受体库的多样性(包括基因重组以及选择性表达)直接反映了机体免疫应答的状态。TCR 可分为 TCR/和 TCR/两种类型, 外周血 T 细胞主要为 TCR/的 T 细胞,是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCR基因由可变区(V)、多变区(D)、结合区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成，形成互补决定区(complementarities determiningregion,CDR)和间隔的 4 个骨架区(frameworkregio

16、n,FR)。3在 T 细胞发育过程中 CDR1，2 和 FR 区域相对保守，CDR3 区由 V、D 和 J 进行重排而形成具有功能的 TCR 编码基因(T 细胞克隆)，由于 V (65-100种)、D (2种)、J (13种)基因片段本身具有多样性，此外，由于在重排的过程中，在 VD 及 D-J 的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了 CDR3 区的多样性(连接形成的多样性约为 2 1011)。这种基因片段连接的不准确性使 TCR 的表达呈多样性, 以识别各种不同的抗原。正常个体在无抗原刺激时，TCR 基因重排是随机的，因此正常人外周 T 细胞呈多家族、多克隆性特点。不同抗

17、原(肿瘤、疫苗、病院微生物或者移植物等)刺激后，TCR V区基因可对该抗原产生特异性识别，并使带有这类基因的T 细胞得到优势扩增，可用于分析不同TCR V亚家族T 细胞的表达和利用。4通过 TCR 技术来实现 T 细胞的过继免疫治疗总的来说可以通过以下两种方法：1.利用分离得出的抗原特异性 TCR 基因，通过构建载体转染一般的 T 细胞，再扩增回输。2.利用分离得出的抗原特异性 TCR 基因，构建一个小分子代替 TCR 链接肿瘤细胞与 T 细胞。而要实现这些技术就要注意以下几点：1.T 抗原表位的选择，T 细胞表位是指抗原经过抗原提呈细胞加工后，由 MHC 分子提呈给 TCR 的短肽。选择合适

18、的 T 细胞表位可以在增加转导细胞特异性识别肿瘤抗原能力的同时减少移植物抗宿主病。根据目前对肿瘤抗原的分类，C-T 抗原、基因突变所致的抗原由于在正常组织仲不表达被认为是 T 细胞抗原表位的最佳选择。目前被鉴定且应用于 TCR 治疗的肿瘤抗原主要有：MART-1、gp-100、CEA、NY-ESO1、MAGE-A3 等。体外实验已经证明，联合两个及两个以上的 T 细胞表位进行 TCR 基因修饰的治疗比单个表位会获得更好的抗肿瘤能力，学习资料 整理分享word 专业整理且同时转导 MHC-1、MHC-2 限制性 TCR 分子可能提高临床治疗效果。2. TCR 基因转导系统 基因转导过程中，最关键

19、的问题是选择合适的载体系统来携带目的基因，使其在靶细胞中得以稳定高效地表达。目前常用的载体系统包括病毒载体系统和非病毒载体系统两大类。理想的病毒载体系统应有较高的转导效率，同时出于安全考虑，应避免含有多个插入位点以防外源基因整合人宿主细胞染色体中。病毒载体系统目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。逆转录病毒载体因其宿主细胞广泛，能高效感染分裂期细胞，可同时感染大量细胞并整合到基因组中长期稳定表达而在基因转导过程中经常被采用，至今它的应用已经超过了 20 年。慢病毒载体主要感染非分裂相细胞(比如造血干细胞)、低分化 T 细胞或初始 T 细胞。与逆转录病毒相比，慢病毒载体有更大的基因容

20、量，转导造血干细胞时插入突变率低，也不易导致转录沉默。慢病毒载体本身携带有启动子，而不需要修饰细胞上的长末端重复序列(10ng terminal repeat，LTR)，故提高了基因转导的安全性。非病毒载体系统转座子是近几年来新兴的一种非病毒基因转导系统，Sleeping Beauty与 PiggyBac 作为最早被用于基因转导研究的两个转座子，因其具有一定的随机整合特性与基因转导效率，转导技术要求低，转座子的获得方便快捷等，为后期应用于临床提供了潜在可能性归。RNA 电穿孔可产生与病毒载体同等的转染效率，但该方法技术要求高，RNA 的半衰期短，易被环境中的 RNA 酶降解等，限制了它在临床上

21、的应用。3. 提高外源性 TCR 基因表达的方法TCR 的功能取决于转导 TCR 的亲和力及其在修饰 T 细胞表面的表达水平。高亲和力 TCR 可识别低浓度的抗原并传递活化信号，增加抗原识别的敏感性与特异性。采用以下几种方法可获得高亲和力的 TCR：(1)抗原肽刺激同种异体反应性 T 细胞产生肽特异 TCR；(2)抗原肽免疫 HLA 转基因鼠得到鼠源性 TCR；(3)体外针对互补决定区 3（CDR3)对 TCR 进行突变，使得突变后的 TCR 具有更高的抗原肽MHC 结合特性；(4)使用密码子优化 TCR；(5)清除 TCR 、链 c 区中的 N-糖基化位点。学习资料 整理分享word 专业整

22、理另外文献报道，T 细胞表面转导 TCR 的密度降低时，细胞被抗原刺激增殖的能力下降，IFN-、IL-2、IL-4 的分泌量均减少，故推测，转导 TCR 在细胞表面的表达水平决定了被修饰细胞的功能活性，足够数量的转导 TCR 是 T 细胞发挥免疫效应的前提。但是在 TCR 基因转导过程中，内源性与外源性 TCR、链之间的配对形成的杂合 TCR 将会稀释转导 TCR 在 T 细胞表面的表达，导致细胞表面转导 TCR 的表达量下降、细胞活性降低。且此杂合 TCR 因未经历过胸腺阴性选择，可能存在增加自身免疫的风险。为了减少内外源性 TCR、链之间的错配并提高转导 TCR 在细胞表面的表达水平，有研

23、究者尝试：(1)用鼠 TCR、链 c 区替换人 c 区。有文献报道鼠源化 c 区更易表达于人 T 细胞表面，使细胞表面 TCR 表达水平增多，进而介导细胞因子分泌功能与杀伤活性的增强，更重要的是，鼠源化 TCR 更倾向于自身配对从而减少与内源性 TCR 配对的几率。(2)在 TCR、链之间引入半胱氨酸，由此形成的第 2 个链内二硫键可介导外源性 TCR、链配对，进而增强外源 TCR 表面表达水平与功能口。(3)将 TCR、链 C 区下游与 CD3分子融合，促进外源性 TCR 、链配对并利于 TCR 信号传导。(4)将人 TCR、链 C 区上最关键的 9 个氨基酸替换为鼠源性氨基酸，不仅极大地降

24、低全鼠 C 区替换带来的免疫原性，同时也可提高外源 TCR 的细胞表面表达水平和功能。(5)对 TCR、链 C 区关键位点的氨基酸进行突变，突变后的 TCR 可优先配对。(6)将 TCR、链基因转导至T 细胞中。(7)采用小干扰 RNA(siRNA)下凋内源性 TCR 的表达。(8)使用小核糖核酸病毒核糖体跳过肽链接 TCR、链，以实现外源性、链的等量表达，减少因、链表达不平衡引起的错配。学习资料 整理分享word 专业整理上图为 immunocore 公司基于 TCR 重新设计的小分子；这也是想学团队的李懿教授所设想的。五、T-IPSc 作为一种新的 T 细胞疗法的优势诱导多能干细胞（IPS

25、c）的发现，在再生医学疗法创造了充满希望的新途径。然而，未分化的 IPSc 的致瘤性是临床转化的一个主要的安全问题。为了解决这个问题，我们通过引入诱导胱天蛋白酶-9（IC9）插入的 iPSC 证实自杀基因疗法的功效。IC9 的激活协同的二聚（CID）的特定化学诱导启动胱天蛋白酶级联消除的 iPSC 和肿瘤源于 iPS 细胞。我们介绍的这款 IC9 / CID 保障体系到 IPSC 衍生，重新焕发活力的细胞毒性 T 淋巴细胞（rejCTL）的治疗模式。实验证实，我们可以生成 iPS 细胞表达高水平 IC9 而不干扰抗原特异性杀伤活性拒绝。 rejCTLs 表达 IC9 在体内发挥的抗肿瘤作用。该系统高效，安全地诱导这些 rejCTLs 凋亡。这些结果联合起来，表明 IC9 / CID保障体系是一个行之有效的手段为未来的 iPSC 介导的方法来指导临床合理用药。学习资料 整理分享word 专业整理图表 8：rejT-IC9-CTL 产生的原理图我们的研究突出 IC9 保障体系的潜在临床意义。最近的研究引入自杀基为基础的保障系统导入小鼠或恒河猴的 iPSCs 报告畸胎瘤形成被显著延迟或仅抑制当治疗注射 iPSC 之前或之后不久。在我们的研