骨科新型医用可降解植入材料JDBM镁合金的生物毒性、髓内针及植入物感染细菌生物膜的基础研究

1、骨科新型医用可降解植入材料JDBM镁合金的生物毒性、髓内针及植入物感染细菌生物膜的基础研究第一部分新型医用可吸收镁合金 JDBM勺生物毒性目的：交大镁合金系列(Jiao Da bio-magnesium series, JDBM )是上海交通大学轻合金精密成型国家 工程研究中心设计开发的生物相容性好、强度和塑韧性相匹配、腐蚀行为近乎均 匀的新型高性能生物医用 Mg-Nd-Zn-Zr (平衡-3-0.2-0.4wt.%)基合金系列，分 为2类，JDBM俱有高强度和中等塑性，应用于骨科；JDBM澳有高塑性和中等 强度，应用于血管支架。该合金体系添加了少量细胞毒性轻微的轻稀土元素Nd作为低合金化元素

2、，Nd的加入可以保证镁合金具有良好的时效析出强化和固溶 强化效果，并可大幅度提高合金基体的电极电位， 减小基体与第二相的电偶腐蚀 电位差，从而提高镁合金的耐均匀腐蚀性能。Zn是人体生理需要的微量元素，微量加入可提高合金强度及塑性加工能力； 微量Zr作为晶粒细化剂可提高合金的强韧性和耐蚀性，其在镁合金中的生物相 容性已经证实。JDBM勺强度、柔韧性、耐蚀性能和生物相容性全面超越已经在 欧洲进入临床实验的WE43B合金。相比于商业性的 WE43fDAZ31镁合金，JDBMft有更好的生物相容性。JDBM 在体内90天时基本完好，在180天时降解少于40%本实验的目的，即通过研究含轻稀土 Nd元素的

3、JDBM1合金及单纯的Nd对 体外培养的小鼠胚胎成骨细胞株 MC3T3-E1的毒性，分析JDBM1合金中稀土元素 Nd的体外成骨细胞毒性，体内实验部分通过研究Nd对昆明小鼠骨及周围组织的 生理病理影响，以及其在小鼠各器官组织中的分布，来研究Nd的生物安全性及其动物体内分布情况。方法：按标准方法用aMEMS养基制作Nd的浸提液，并稀 释为1/2、1/4、1/8几个不同的浓度梯度，同时制作Ti合金、WE43B合金、JDBM 镁合金及CaP涂层JDBMft合金的浸提液，以正常培养组做空白对照，以Ti合金 浸提液组做阴性对照，以0.64%苯酚组做阳性对照，用含10蹴洲胎牛血清的aMEM 培养基对MC3

4、T3-E娥骨细胞进行培养，观察其不同时间的形态变化及增殖情况， 并以CCK8法检测其不同时间的细胞增殖活性，以 Annexin V PI双染色流式细胞 术检测不同时间的细胞凋亡情况。将梯度量的Nd微粒加入正常培养的成骨细胞培养液中，最低量接近JDBM植入物释放的Nd量，观察微粒入胞情况，并制作细胞爬片，用电子目镜接普通 显微镜直接动态观察细胞吞噬Nd微粒的情况，然后行H成色观察细胞形态变化。 体内实验部分，将不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁组织，检测1、3、5天小鼠 的血液电解质、肝肾功能变化、Nd在小鼠体内的分布及局部病理切片观察 Nd微 粒引起的病理变化。结果：用CCK8ft检测细胞增殖活性

5、，Nd浸提液原液组细胞毒性较大，与苯 酚阳性对照组实验结果一致，其与正常对照组、Ti合金浸提液组、JDBMS提液组、WE43g提液组、Nd浸提液1/4、1/8浓度组相比P 0.00001 ,而后几者 之间无明显统计学差异。Nd浸提液原液及苯酚组与Nd浸提液稀释至1/2组之间 P 0.01 ,有明显统计学差异。从流式细胞术检测结果得知，随 Nd浸提液浓度及作用时间的增加，成骨细 胞凋亡明显增多。微粒入胞实验动态及静态观察发现，成骨细胞通过主动胞吞作 用吞噬周围环境中的Nd微粒，微粒较少时细胞生长无明显影响，微粒量多时则 可导致成骨细胞膜破裂，直至细胞崩解死亡。通过计算比较，JDBMS WE4讣N

6、d2.5%右的含量可能会导致周围细胞的损伤。将不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁组织，小鼠的血液电解质及肝肾功能较 正常组无明显变化。小鼠体内各组织器官的Nd元素分布因无合适的检测合作单位而待测，病理 组织切片显示大量的Nd微粒对周围组织细胞有一定的损伤。结论：Nd浸提液的成骨细胞毒性及对成骨细胞凋亡的影响随浓度的减小而减小，JDBMfr微量Nd对成骨细胞无明显毒性；成骨细胞通过主动胞吞作用摄取周围环境中的 Nd微粒， 当微粒数量达到一定程度时，成骨细胞崩解，JDBMfr微量Nd颗粒对成骨细胞的 增殖及形态无明显不良影响。相对于Nd微粒的细胞损伤，JDBMm WE4”的Nd含量可能过高。Nd微粒对

7、 小鼠的肝肾功能、电解质无明显影响，多量的Nd微粒对周围组织细胞有一定的损伤。第二部分新型医用可吸收镁合金 JDBM勺髓内降解及病理生理效应目的：生 物体内可降解吸收材料是生物材料发展的重要方向，由于金属材料具有较好的强 度和塑韧性，因此金属基可降解吸收材料具有重要的临床应用价值。镁是所有金 属材料中生物力学性能与人体骨最接近的金属材料，具有理想的生物力学相容性， 因此，镁合金作为可降解生物材料具有巨大的应用潜力。目前临床应用的生物体内可降解吸收材料主要是聚合物和某些陶瓷材料，如聚乳酸、磷酸钙等。但由于聚合物材料强度偏低、陶瓷材料的塑韧性较差限制了 其广泛使用。近年来，以生物可降解镁合金(bi

8、odegradablemagnesium alloys) 为主要代 表的具有生物可降解(吸收)特性的新一代医用金属材料的研究受到了人们的特 别关注。镁合金因具有与人体骨头接近的密度和弹性模量、高比强度和比刚度、 生物可降解性以及生物相容性等优点，近 10年来国内外研究人员对其应用于骨 内植物、骨组织工程支架和心血管支架等领域进行了广泛的研究。然而，目前大多数研究均以现有商用镁合金为对象，如含 Al元素的AZ31、 AZ91以及含重稀土元素的WE4转，并未考虑到作为生物材料的安全性等问题。 上海交通大学轻合金精密成型国家工程研究中心，作为我国重要的镁合金材料及精密成型工艺研究的国家级研究基地，近

9、年来在可降解医用镁合金材料研究领域 也取得了令国际同行瞩目的研究成果。该研究中心研究人员与医学研究人员合作，积极开展生物医用镁合金材料的 临床应用基础研究。上海交通大学研究人员运用第一性原理计算与分子动力学模 拟方法，并与实验相结合，从原子、分子水平深入系统地探索了镁的变形机制， 定量评估了所优选的生物相容性好的合金元素对镁中层错能及位错滑移、李生等变形倾向的影响，设计开发了生物相容性好、强度和塑韧性相匹配、腐蚀行为接 近均匀腐蚀的新型高性能生物医用镁合金 Mg-Nd-Zn-Zr基合金系列(Jiao Dabio-magnesium series ,简称JDBM)已经分别申请中国和国际专利保护。

10、该合金体系中通过加入少量细胞毒性轻微(临床可接受)的轻稀土元素Nd作 为低合金化元素，Nd的加入可以保证镁合金具有良好的时效析出强化和固溶强 化效果，并可大幅度提高镁合金基体的电极电位，减小基体与第二相的电偶腐蚀电位差，从而提高镁合金的耐均匀腐蚀性能。JDBMT降解镁合金自研制成功以来，一直在进行各项临床前实验研究，以了解其各项生物学性能，以便进一步改 进其各项性能并争取早日应用于临床医疗实践中。我们已经做了一些JDBM1合金钉板系统方面的研究，取得了许多重要的第 一手资料，但尚未进行JDBM!合金髓内针方面的实验研究。本实验的目的在于 检测可降解JDBMi合金髓内针对大鼠股骨代谢的影响及其病

11、理生理变化，并检 测JDBMi合金髓内针在大鼠股骨髓腔内的降解行为，通过动物实验研究对本材 料的医用价值做出一定程度的评估。方法：将JDBMS合金及对照的Ti合金、WE43!合金、CaP涂层JDBM故成 1mm x30mrffi髓内针，消毒后进行无菌手术将其植入雄性SD大鼠左侧股骨髓腔内，每组6只。在1、3个月进行99mTc-MD骨三相3描及SPECT-C检查，通过 骨显像核素扫描了解大鼠股骨植入 JDBMi合金髓内针后的代谢状况，比较与对 照侧及对照组的差异。1、3个月拍摄X线片了解髓内针的位置与降解的大体情况。 在15天，1、3、 6个月检测大鼠的血生化电解质变化。3、6个月做骨组织病理硬

12、切片，通过骨硬组织切片观察大鼠股骨的病理变 化，并检测不同时间髓内针的降解情况，确定其降解速率。结果：JDBMK内针组大鼠股骨的放射性标记物摄取率明显高于对侧股骨及Ti合金对照组，P0.01 ,与WE43H及CaP涂层JDBMfi相比无明显差异。骨三相扫描显示镁合金髓内针植入侧血供旺盛。血电解质检测各组未见明显 差异。大鼠月骨X线片摄片显示，1、3月时JDBMffi内针形态完好，密度均匀，但 6、8月时影像略显模糊，X线透光程度不等，CaP涂层JDBMffi内车+及WE431内 针也出现程度不等的类似变化，可能系镁合金刺激周围骨组织增生所致。大鼠骨 硬组织病理切片显示，JDBMK内针在大鼠髓腔

13、内缓慢降解，并促进骨组织增生， 未见明显畸形细胞。与Ti合金组相比，JDBMS CaP涂层JDBMfi、WE43a髓内针周围成骨明显1个月、3个月、6个月的时间内，JDBM髓内针在大鼠骨髓腔内缓慢降解，至 6个月时降解不超过20%直径由最初的Imnil大于0.8mm质量减少不超过20% 而CaP涂层JDBMfi降解更为缓慢，WE43&降解略快于JDBMfi, Ti合金组无降 解。结论：JDBM对实验动物大鼠的血清肝肾功能、电解质无明显影响。JDBM在大鼠髓腔内4个月时降解比较轻微，刺激周围骨组织增生的作用已经显现，6个月时周围骨组织明显增生，相应的 JDBM内针影像略显模糊，应力遮挡效应 减弱

14、。JDB嘛镁合金髓内针可导致大鼠局部核素摄取增多，表明局部代谢旺盛， 镁合金有促进大鼠髓腔内代谢的作用。JDBMK内针可促进骨代谢及骨形成，有 利于损伤骨组织的修复。JDBMI!合金髓内针在骨髓腔内逐渐P1解，后期降解趋于缓慢。JDBM& CaP涂层JDBM WE43M内针植入大鼠股骨后，其髓腔内组织皆未发现明显的不良反 应。第三部分新型医用可吸收镁合金 JDBMf葡萄球菌粘附及生物膜模型目的： 骨科假体植入后葡萄球菌感染是世界范围内比较棘手的问题，医疗实践中通过应用各种材料改性技术和研发新材料等方法以期减少感染的发生。关节假体感染(prosthetic joint infection , P

15、JI)和无菌性松动是人工关节置换术后的重 要并发症。在美国，PJI是导致人工全膝关节置换术失败的首要原因，也是人工全牌关 节置换术失败的第三大原因。微生物生物膜(biofilm , BF)作为PJI的病原基 础，对感染的发生、发展和转归具有决定性作用。根据临床统计，导致关节假体感染的主要致病菌为表皮葡萄球菌。金黄色葡 萄球菌是创伤感染中最常见的病原前，而且可引致败血症、痔、脓月中等。作为人兽共患病的重要病原菌，其致病性长期来为医学家所关注。但往主要 对凝固酶、葡澈酶等胞外酶及肠毒素、杀白细胞毒、表皮剥脱毒素及毒性休克综 合征毒素I等外毒素进行了研究，而忽视了对其牯附机制的探讨。众所周知，粘附是

16、细菌感染的先决条件，否则细菌就无法定居和繁殖，也不 能产生和释放胞外酶和外毒素=粘附虽非直接导致组织受损，但对组织的选择和 疾病的严重程度却有重要的影响。因此，近年来在对金黄色葡萄球菌胞外产物研 究日渐深入的研究，同时，对其粘附机制的研究亦获长足的进展，发现金黄色葡萄球菌有数种粘附素。根据临床统计，导致关节假体感染的主要致病菌为表皮葡萄球菌。表皮葡萄 球菌存在于人体的体表，与其他正常菌群一道构成人体皮肤粘膜等的微生态共同 抵御外来微生物的侵袭。同时由于寄生部位改变，在凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase NegativeStaphvlococcl ; CoNS引起医院感染中最为常见。国外报道

17、表葡占CoNS勺57%和68%,特别是在病人体内留置医疗器械引起的感染中表葡是最重要的病原之 一，占 39%。表皮葡萄球菌通过ica fIntercellular Adhesion）操纵子表达多聚糖胞问粘附因子（Polysaccharide Intercelluar Adhesion PIA）,使之粘附于器械静脉 导管、人造心瓣膜、人造关节、人造血管、心脏起搏器及隐形眼镜等）表面，形成一层菌膜，以抵抗机体免疫系统和抗生素的攻击，是表葡引起留置器械相关感 染的重要环节。本院骨科假体感染分离出来的致病菌以表皮葡萄球菌为主本实验的目的在于探索新型可降解材料 JDBMi合金对于葡萄球菌的表面粘 附及生

18、长增殖的影响，并制作 JDBMft合金植入动物体内的感染模型，以研究新 材料JDBMS合金的临床适用性。方法：将 JDBMS合金、WE4软合金、Ti合金 制成1mm x10mri圆形薄片，进行环氧乙烷消毒。细菌采用RP62A ATCC1222繇菌株，用细菌比浊仪，以 TSB培养基调节细 菌浓度至约0.5麦氏单位(菌量约1x108/ml),然后在4.5ml EP管(eppendorf 管)中加入2ml调好的细菌，加入无菌合金圆片共培养1至3天，每种材料各做 一个重复培养的EP管。吸去TSB培养基，用PBS冲洗金属片3次，然后加入2ml PBS放入超声震荡仪中，中等强度超声能量分别震荡 5、10分

19、钟，将所得液体 分别按102、104梯度用PBSffi释，各取100ul稀释后的PBS菌液并划到血平板， 培养24小时后作细菌计数，看各组间粘附的细菌量有无差异。实验检测金属片表面不同粗糙度对细菌粘附的影响。动物实验部分，将JDBM WE43M合金及Ti合金做成3mme10mm5勺螺钉，用环氧乙烷熏蒸法消毒，严格无 菌操作下将实验螺钉植入普通级新西兰大白兔左侧股骨外上牌，手术伤口愈合后将菌株ST239SF8300以PBSSM至0.5麦氏单位，并将细菌浓度稀释至1x105/ml , 分别注射各菌株0.5ml至实验兔的股骨旁组织靠近植入的螺钉，生理盐水注射作 为阴性对照，于注射细菌后第1、3周时拍

20、摄实验兔的股骨X线片，并于第3周 拍摄实验兔的股骨x线片后将其处死，做局部组织病理切片检查，同时取局部分 泌物涂片行姬姆萨染色，将细菌行血琼脂平板培养一日后涂片检查，最后进行细菌类别鉴定。结果：开始所用的JDBIM WE43 Ti合金组材料光滑度相同，结果发现RP62A 及ATCC12228勺细菌粘附并无明显差别，其血琼脂培养板的细菌计数在一个数量级，而改变金属圆片的表面光滑度后， 再次进行实验，发现粗糙度大的金属片表面粘附了更多的细菌，其粘附细菌量的多少与粗糙度成正相关。动物实验部分， 细菌ST239注入兔股骨植入物旁，第1周和第三周时均可见发生严重的局部反应， 有大量的乳白色乳酪样物质产生

21、，SF8300注射后局部有少量乳白色乳酪样物质 产生，直接涂片瑞氏染色及血琼脂平板培养后涂片瑞氏染色检查，皆发现大量细菌存在，经鉴定，确定感染的细菌为实验所注射的细菌， 而生理盐水注射后局部 无明显化脓及分泌物产生。结论：JDBM WE43 Ti合金材料本身对于葡萄球菌的粘附量无明显差异， 但不同的材料表面粗糙度对于细菌的粘附有明显影响，材料表面粗糙度越大，细菌粘附越多，材料表面越光滑，细菌粘附越少。我们通过在实验动物新西兰大白 兔的股骨植入物旁注射1x105浓度的细菌ST239f艮容易造成假体感染生物膜的动 物模型，注射SF8300可以造成轻度感染，而注射生理盐水未造成明显的局部感 染及生物

22、膜形成。有植入的假体存在的情况下，不同种类细菌对兔股骨旁组织的感染能力及假 体成膜能力不同。第四部分JDBM!合金、纤维蛋白原与葡萄球菌成骨细胞内化 作用目的：在骨科感染中，多种致病葡萄球菌可以进入成骨细胞， 在其中生长繁 殖，产生毒素，破坏细胞，并造成细胞的损伤与崩解坏死，或长期存活于细胞内， 导致抗生素不能对其进行杀伤。内化是生物大分子（包括细菌、病毒等）进入细胞内的膜泡转运过程。广义地 说，内化是指活细胞在生活状态下，自外环境中摄取物质分子的一种模式。小分子物质如水、氨基酸、单糖以及离子等，可借助细胞膜的通透性机制而 直接进入细胞内。但生物大分子物质（如细菌、病毒等）不能直接通透细胞膜，

23、常 常需先在细胞膜的某些区域产生凹陷，将其包裹于小的膜区域内，随后凹陷进一 步向细胞质内延伸，并与细胞膜脱离，在细胞质内形成独立的膜性小泡，引发一系 列相关界膜小泡的生成、融合、转运及分离，上述生物大分子进入细胞内的膜泡 转运全过程称之为内化,亦称为内吞作用(endocytosis)。其主要形式有吞噬作用(phagocytosis)、吞饮作用(pinocytosis)、受体介导的内化(receptor-mediated internalization) 、越胞彳用(d-iacytosis) 和穿细胞吞吐作用(transcytosis)等。它是当今生命科学研究的重要课题之一。金黄色葡萄球菌(st

24、aphylococcus aureus, SA)能侵入成骨细胞内，其侵入 能力与菌株本身特点有关。金黄色葡萄球菌侵入成骨细胞后能逃避庆大霉素的杀 菌作用，这可能与临床上骨髓炎不易为抗生素治愈有关。金黄色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要来源，约有65%70%J骨髓炎由金黄色葡萄球菌引起。有研究表明金黄色葡萄球菌能侵入某些体外培养的宿主细胞，如成纤维细胞、鼠的肾细胞、内皮细胞等。金黄色葡萄球菌的这种侵入真核细胞的能力可能与其引起骨髓炎的病理机制有关。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)是一种革兰染色阳性、凝固酶阴性的葡萄球菌，一般粘附于人体的皮肤和

25、黏膜，是重要的条件致病菌，近 年来随着留置静脉导管，植入人工心瓣膜、人工晶体、人工假体等侵袭性操作的 增加，表皮葡萄球菌的感染率不断上升，并且由于抗生素的广泛使用甚至滥用， 导致表皮葡萄球菌耐药菌株日益增多，出现了多重耐药。表皮葡萄球菌在生物材料表面形成的生物膜是其致病的主要因素， 生物膜的 形成需要许多因子的参与，这些因子又受相关基因的调控。由于表皮葡萄球菌分 泌的毒性因子较金黄色葡萄球菌少，导致其致病的主要因素是表皮葡萄球菌粘附于植入体内的生物材料表面形成生物膜，它不仅使宿主体内的免疫反应呈抑制状 态，促使表皮葡萄球菌增殖，而且其黏液阻碍了亲水性的抗生素进入菌体发挥杀 菌作用，使感染呈慢性

26、、持续性和反复性的特点。本实验的目的即在于研究不同的临床株表皮葡萄球菌对成骨细胞的内化作 用的差异，并研究JDBMS合金及纤维蛋白原对实验细菌内化作用的影响。方法：将MC3T3-E1成骨细胞以每孔1ml含10哪洲胎牛血清的DMEM&养基培养于24 孔板，每孔细胞量5x104,连续两天更换培养基，至细胞生长至超过50%ff积。以含胎牛血清的DMEME全培养基通过菌量比浊仪调整23株临床株及标准对 照株细菌ATCC12593勺细菌浓度调至0.5麦氏单位，约1x108/ml。吸去培养孔 内的培养基，每孔分别加入1ml含实验细菌的培养基，置于37c的二氧化碳孵 箱孵育2小时，然后以PBS洗三次，每孔加

27、入含90ug/ml的万古霉素的DME流 全培养基1ml,置于二氧化碳孵箱37c培养2小时，以PBSa三次去掉细胞外被 万古霉素杀死的细菌，加入0.1%曲拉通作用10min,使细胞崩以解释放进入细胞 内的细菌，将所得液体用PB驱102、104浓度梯度稀释后，以血琼脂平板划板， 在35c的条件下培养，次日观察平板有无细菌生长，对有细菌者比较数量级差 异并计数。重复实验3次并比较结果异同。至于纤维蛋白原对细菌内化的影响部分， 将 MG63f肉瘤细胞用含10%M洲胎牛血清的DME册养基培养于24孔板，待细胞生 长至接近铺满底面积，把9株骨科临床假体感染分离的致病菌及 ATCC12228 ATCC125

28、98 RP62AK 1x108/ml细菌浓度，每孔1ml细菌液接种的于各培养孔， 每株细菌按是否加纤维蛋白原做 2个复孔，培养3小时后，吸去培养液，每个培 养孔中各加入1ml含100ug/ml万古霉素的完全培养液，37c条件下在二氧化碳 孵箱内培养培养细胞并过夜。次日吸去各培养孔中的培养液，将各培养孔用PBS洗3遍，然后每孔加入PBS配制的0.1%曲拉通作用10min,以使细胞崩解，释放出进入细胞内的细菌， 所得液体将原液及102稀释液划于血琼脂培养板，在 35c的孵箱内培养过夜， 次日观察有无细菌生长，计数生长的细菌。纤维蛋白原和JDBM寸细菌内化的影响方案基本同前。纤维蛋白原对细菌内化的影响部分，将 MG63t肉瘤细胞用含10%M洲胎牛 血清的DMEM6养基培养于24孔板，待细胞生长至接近铺满底面积，把9株骨科 临床假体感染分离的致病菌及 ATCC12228 ATCC12598 RP62A 1x108/ml细菌 浓度，每孔1ml细菌液接种的于各培养孔，每株细菌按是否加纤维蛋白原做