从柏科植物中分离具有抗肿瘤、抗真菌、抗菌活性的内生真菌

1、从柏科植物中分离具有抗肿瘤、抗真菌、抗菌活性的内生真菌摘要 最近的研究可以看出柏科植物体内分离的内生真菌的生物勘探情况。本篇文章主要探讨健康寄主植物如柏木属、杉属、侧柏属体内高活性的内生真菌菌种。本文中，内生链格孢菌、链格孢菌、链格孢属是从健康的桧柏球体内分离出的。内生真菌生物活性和生物多样性的恢复是一个生物地理学和主机标识。我们同样研究了链格孢菌的代谢产物，突出了他们的抗增殖、抑制生长的能力以及对稻瘟、梨火疫病菌和丁香假单胞菌等模型目标菌的抗菌活性。总之，自从链格孢菌被发现，它们总是作为致病性和致敏真菌被报道，我们的研究表明了它们在桧柏植物叶面组织的一个可能的其它生态位。此外，在这项研究中，

2、我们还报道了柏科植物家族之间内生链格孢属的显著的生物活性。引言目前正在对从许多寄主植物中分离物种的生物多样性和植物内生菌的生物活性进行调查。最近的研究强调，柏科植物中寄宿了许多种类的内生菌。我们的研究进一步表明，柏科植物内生菌具有一定宽度范围的生物活性。例如，抗真菌、抗细菌和抗增殖活动。在最近几年，已经常证明寄主植物的内生菌可以产生与寄主植物相同的生物活性分子。柏科植物家族的物种广泛被用于药材中。因此，由桧柏球植株体内的内生微生物生产的代谢产物的生物活性可能与植物本身的代谢产物生物活性类似。因此，一些药物发现的项目表明，可以利用柏科植物体内的一些内生真菌来生物合成抗癌因子。因此，研究柏科植物中

3、内生真菌的定植可能会发现除真菌多样性之外的其他生物活性分子来源。链格孢属的真菌（座囊菌纲、子囊菌门）广泛分布在植物，土壤，食品，环境和室内空气中。链格孢属物种作为植物病原菌、弱兼性寄生菌、腐生菌以及内生菌已经适应了各种各样的生活方式。特别是在免疫功能低下的人群中一些链格孢属菌已成为人体的病原体，它们是人类常见的过敏原。其中哮喘，暗色丝孢霉病，灰指甲，鼻窦炎，溃疡皮肤感染，角膜炎，内脏感染骨髓炎都是由链格孢属真菌引起的，其中链格孢是最常见的一种。链格孢菌也因为它可以制作生化药剂的本领而为人类所熟知，如生产植物毒素和真菌毒素。在过去的几十年里，至少有268种链格孢属真菌产生的关于植物毒性、细胞毒性

4、和抗菌性能的生物分子被报道。据我们所知，在柏科植物中已经有大量的真菌被报道。从崖侧柏的体内收集了斑点落叶病和黑斑病的内生真菌。柏科植物家族（松柏类）广泛分布于地球的每个角落。前面的研究展示了它们物种组成的多样性，物内生菌的生物活性可显著由寄主植物或寄主植物的局部生长来影响。此外，有对对抗癌症和传染性疾病在人群中传播和对植物非生物胁迫所需生物分子的持续的需要。我们组以前报道的柏科植物中内生青霉菌和木霉属青梅真菌的生物多样性和生物活性。我们关联了从柏科植物家族中分离的链格孢真菌的生物活性尤其是柏科植物内生链格孢属的抗增殖、抗真菌能力。材料与方法取样地点与植株在伊朗不同省份的几个地方，表明取样的代表

5、性，分别是从法尔斯（南伊朗），桂兰（伊朗北部），哈马丹（伊朗西部），和 中央（伊朗中心）进行植物材料的收集。从绿干柏、意大利柏木、刺柏棕竹、圆柏属、侧柏等植物标本（树枝的叶子，干皮，水果）收集（表1）。内生真菌的获取与鉴定用参考文献里的方法从成熟的健康桧柏球植株中收集无炎症的新鲜叶片组织。在2011年6月-10月份每一个地区取样至少设置三个重复。从每个植物标本中，随机抽取三件根据参考文献进行表面消毒，共820植物碎片孵育在PDA固体培养基或水琼脂培养基中（WA），在26-28放置2-12周，从生长的菌丝顶端分离真菌并进行纯化，4保存。内生链格孢分离株的鉴定是通过研究其菌落形态和产孢PCA机制（

6、土豆胡萝卜琼脂培养基）来实现的，在16/8光照黑暗间隔22-25放置7d。根据参考文献，对真菌标本进行染色，在显微镜下观察。生物测定模式细菌和真菌使用模式目标菌稻瘟病真菌HS-1390和目标植物病原芽孢杆菌来检测链格孢菌代谢产物提取提取的抗增殖和抗菌活性物质。欧文式菌、假单胞菌由A. Ghasemi植物研究所提供。在体外首先利用稻瘟病菌对内生真菌菌株活性进行初步测试，然后再利用其它的松柏植物病原病菌。色二孢属真菌、Spencermartinsia viticola等来自库尔德斯坦大学，伊朗。子囊菌门以及所有的真菌和细菌菌株都在4长期保存。链格孢菌的代谢产物提取对细胞内外代谢产物的提取按照之前的

7、方法进行。简单来说，将链格孢菌株接种于马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中，在28、120r/min、黑暗条件下培养15d。然后将培养液用甲醇提取，将发酵液过滤得到胞外代谢产物。然后将有机溶剂和甲醇按照1:1的比例添加到过滤后的培养液中，然后将其转移到4条件下12h来去除蜡质材料。采集有机相，采用50条件下蒸发有机溶剂。干燥的甲醇抽提物溶解在蒸馏水或DMSO中使其终浓度为250lg/mL。最后在测定生物活性前过直径为0.22微米滤膜。对于胞内代谢产物，先获取菌丝体的生物量，洗干净后，浸入1:5甲醇中2天。菌丝均匀分布。上清液进行进一步处理，方法同获取胞外代谢产物。生化分析前，将次生代谢产物放置到-20

8、冰箱中。抗增殖测定链格孢菌抗增殖的/细胞毒性的内外代谢产物以检测稻瘟病菌分生孢子的萌发为模型。稻瘟病分生孢子悬浊液(4.9x104 mL-1;0.02%酵母提取物/50mL)接种在96孔板上。样品提取液（50ml）通过连续稀释到最终浓度为250, 125, 62.5, 31.25, 15.62, and 7.81 lg mL-1.，添加到每个孔内。检测板在24条件下培养16h，将每个样品的提取液，起源于75分生孢子种子的萌发和芽管的尺寸放在显微镜下观察，与对照相比获取最低的抑菌浓度（MIC检测）。试验设置三个重复。抗菌实验体外抗真菌链格孢属菌株使用稻瘟病菌进行初步测定，然后再通过对霜霉病菌等进

9、行实验。本试验将链格孢属真菌与每一个目标真菌接种到PDA平板上。将链格孢属取5mm菌丝盘在28条件下在平板的一侧传代培养。当链格孢菌覆盖了整个平板一半的面积时，将目标菌株接种在平板的另一侧，置于28条件下培养。随着目标真菌的日益生长，在每个链格孢菌存在的平板都与对照组相对照，直至对照组真菌长满整个平板。抗真菌作用的大小是通过测定抑制区相对于对照组的直径来衡量的，通过以下公式计算生长抑制率：生长抑制率（%）=（对照组直径-处理组直径）/对照组*100%。抑菌（MIC）和杀菌（MBC）的测定利用离火疫病菌和丁香假单胞菌等来衡量细胞内外代谢产物的抗菌活性。首先获得1x106 cfu/mL的细菌生长液

10、，然后在肉汤培养基（NB）中利用肉汤稀释法进行抗菌检测。将检测板放置在28条件下培养16h，观察和比较目标细菌的生长情况来进行抑菌和杀菌测定。实验设置三个重复。以IC80值的获取和展示代谢产物具有80%体外抑制作用的浓度。统计分析利用SAS软件对进行抗真菌实验获得的数据进行方差分析（ANOVA）及最小显著差异试验（LSD）。不同处理之间的显著差异水平为5%（P0.05）结果链格孢菌物种的宿主标示、生物地理学和物种多样性从生长在伊朗四省的绿干柏、意大利柏木、刺柏棕竹、圆柏属、侧柏等植物上采集了820个植物标本。从宿主标本植物中得到110株真菌（13.4%定植率），包含了19个真菌属的35种真菌，

11、其中链格孢菌占7.7%。总的来说，得到了8株链格孢属的菌株。此外，内生链格孢菌住只在法尔斯（南伊朗），哈马丹（伊朗西部）Cupressus arizonica, Cupressus sempervirens var. cereiformis 物种中发现（表1）。由此可见，链格孢菌属主要存在于法尔斯省侧柏的枝叶中，平均温度16.58（表1）。表1从每个柏科植物宿主中分离的内生链格孢菌株，按照采样点、植物种类、真菌种类制表 链格孢菌产生的抑制/细胞毒性细胞内外代谢生物活性物质。稻瘟病菌常作为抗癌和抗真菌微生物代谢产物初步筛选的抗癌和抗真菌初步筛选的模式菌株。我们目前的研究表明，柏树内生真菌的细胞外

12、代谢产物比系胞内代谢产物的活性更高。因此，从稻瘟病菌分生孢子萌发和芽管的产生用于评价内生菌培养的细胞内外代谢产物的抗增殖和生长抑制活性。数据通过表2和表3展示。表2 内生链格孢菌胞外代谢产物对稻瘟病菌分生病菌的抗增殖活性测定数值为4-6组数据的平均值+，稻瘟病菌分生孢子萌发被完全抑制；+，稻瘟病菌分生孢子萌发被抑制为1/3；+，稻瘟病菌分生孢子萌发被抑制为1/3-2/3大小；-分生孢子大小与对照组相似表3内生链格孢菌胞内代谢产物对稻瘟病菌分生病菌的抗增殖活性测定数值为4-6组数据的平均值+，稻瘟病菌分生孢子萌发被完全抑制；+，稻瘟病菌分生孢子萌发被抑制为1/3；+，稻瘟病菌分生孢子萌发被抑制为

13、1/3-2/3大小；-分生孢子大小与对照组相似结果发现，链格孢菌的胞外产物对稻瘟病菌孢子萌发有明显的抑制作用（表2）。值得注意的是，链格孢CSE177 和CSE165(均是从C. sempervirens var. cereiformis)中分离)，在62.5 lg mL-1浓度时均展现了抗增殖活性和在7.8 lg mL-1浓度时展现了抑制芽管伸长的作用。菌株POE103和POE182也表现出了在这两方面很强的活性。同时，如表三所示，链格孢菌的细胞内代谢产物对稻瘟病菌的分生孢子起明显的抑制作用。令人惊讶的是，链格孢菌CAE92细胞内外代谢产物（其中胞外产物显示在所有最小的抗增殖活性）展示出了最

14、高的细胞毒作用。事实上，它的胞内代谢产物毒性在125 lg mL-1，在31.2 lg mL-1芽管伸长的强抑制作用。链格孢菌的抗真菌活性我们通过采用平板对峙的方法，利用稻瘟病菌分生孢子的数据来进行评估内生真菌对模式稻瘟病菌、柏树植物病原菌D. seriata, Phaeobotryoncupressi和Spencermartinsia viticola的抗真菌活性。事实上，所有的内生真菌分离株在体外菌会有65%-92%的抗菌活性，尤其是对稻瘟病菌（表4）。总的来说，链格孢菌CAE92 和A. pellucida POE182是对所有目标菌最有效的菌株。此外，链格孢菌 CSE177 和链格孢菌

15、CSE165 对所有目标菌也有比较明显的效果。.用培养皿法，A. tangelonis POE103胞外产物的抗真菌活性最高。表4 柏树内生链格孢菌对柏树病原真菌和模式稻瘟病菌的抗菌活性观测数据为3组数据（显著水平P0.05）平均值。相同字母表示差异不显著。、表5 内生链格孢菌细胞内外代谢产物的抗菌活性观测数据为3组数据（显著水平P0.05）平均值。a 最小抑菌浓度 b 最小杀菌浓度链格孢菌细胞内外代谢产物抑菌和杀菌活性根据表2表3和表4的数据，植物内生的 链格孢菌 CAE92, A. tangelonis POE103, 和A.pellucida POE182细胞内外代谢产物的分离用来进一步

16、研究其对模式芽孢杆菌、离火疫病菌以及丁香假单胞菌的抗菌能力。如图所示，所有内生菌的代谢产物对三株革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑菌和杀菌的活性（表5）。胞外代谢产物的抑菌范围在7.831.2 lg mL-1，杀菌范围同样在7.831.2 lg mL-1。细胞内代谢产物的抑菌范围在15.662.5 lg mL-1，杀菌范围在31.2125 lg mL-1。此外，链格孢菌CAE92和A. tangelonis POE103对革兰氏阴性菌更有效，然而A. pellucidaPOE182对革兰氏阳性菌更有效。讨论很明显所有的高等植物均会寄宿有一个或多个未被开发出来的内生菌。这些微生物主要寄居在植物组织的表皮

17、层之下，而不会引起任何症状。内生微生物产生的次级代谢产物具有独特的杀虫、杀线虫、抗菌、促进植物生长效果，并可以强化寄主植物的环境耐受能力或者作为触发一些现象的信号分子。此外，内生菌产生的活性代谢产物是新型生物分子最有可能的来源，其独特的遗传和生物特性可以应用在林业、农业、医药和生物应用等领域。柏科植物成员遍布全球，在林业、农业、医药等领域广泛使用。这类植物包括柏属、圆柏属等。其中，柏杉原产于地中海东部。最近的研究显示，健康的Juniperus virginiana,Cupressus arizonica, 和 T. orientalis树寄宿有大量的内生真菌。同时我们的研究展示了在不同的相近物

18、种中，几乎有相同数量的真菌种类。这进一步表明，寄主植物和取样地点影响从柏科植物中分离内生真菌区系的多样性。此外，我们对从柏科植物体内分离的内生真菌生物活性的研究，已经展示了显著的抗增殖、抗真菌以及抗细菌能力。其他人的一些研究也证明从柏科植物内生真菌中可以分离出一些抗原制备的物质，如紫杉醇和鬼臼毒素等。本文中，我们讨论了内生链格孢属真菌对柏科植物健康组织的地上部分的影响以及它们的生物活性。如图所示，分离的八个内生真菌分别代表链格孢菌以及A. pellucida,、A.tangelonis。这进一步证明了子囊菌作为柏科植物内生菌的优势。大多数的菌株（75%）属于链格孢菌。真菌A. pellucid

19、a 和 A. tangelonis仅从法尔斯省的香蒲植物中获取到。有趣的是，美国报道的斑点落叶病菌也是从香蒲植物中获得的。在我们的研究中似乎法尔斯港口有比其它地方更多的内生真菌。这佐证了我们之前的研究，证明了我们从美国获得的对内生真菌种群生物地理学研究的准确性。此外，考虑到之前和现在获得的结果，法尔斯省特有的Cupressus sempervirens var. cereiformis展示了内生真菌高度显著生物活性的巨大潜力。这可能展示了伊拉克特有柏科植物和其内生真菌之间相互进化的关系。这种关系可能对宿主柏树起到保护作用，如非生物胁迫作用。此外，我们的研究表明柏科植物内生菌是一个新型生物源。事

20、实上，只有从桧柏球植物中分离的链格孢菌作为植物病原菌之前被报道过。因此，报道内生真菌链格孢菌, A. pellucida和 A. tangelonis 之间的联系是新颖的。这进一步提高了通过探索发现更多内生真菌种类的可能性。这些研究还表明内生真菌可以寄居在桧柏球植物中而不引起其其它的病症。值得注意的是，最近强调的内生真菌(比如从香蒲植物中分离的苹果斑点落叶病菌)与其它的细菌有共生关系，这表明了这些微生物与宿主植物之间复杂的相互关系。通常来说，链格孢菌是一种严重的植物致病菌与人体条件致病菌。已经被用到不同宿主植物中来合成前景良好的生物大分子，如抗癌生物碱：喜树碱。链格孢菌系和A. tangelo

21、nis主要作为植物病原菌。本文我们介绍了内生链格孢菌株与健康的柏科植物之间的联系。此外，我们首次研究了柏科植物内生真菌的抗增殖、抗真菌以及抗细菌能力。我们的数据表明，内生链格孢菌的胞内代谢产物与胞外代谢产物相比具有明显的细胞毒性。如链格孢菌 CAE92，胞外代谢产物具有最低的细胞毒作用，但胞内代谢产物的细胞毒性最高。这种从桧柏植物中分离的菌株在培养皿对峙试验中，是对抑制稻瘟病菌、Phaeobotryon cupressi和 Spencermartinsia viticola菌丝生长最有效的真菌，具有92%、88%、87%的抑制作用。所以这些菌株的生物活性受复杂的因素所影响。而且，链格孢菌CSE177和链格孢菌CES165产生的细胞内外代谢产物的毒性最强。这两株菌与对照相比可以抑制目标真菌80%-85%的菌丝生长。有趣的是，这两株菌也是从Cupressus sempervirens var. cereiformis中分离的。我们的抗菌试验表明，链格孢菌能抑制稻瘟病菌、Phaeobotryon cupressi和 Spencermartinsia viticola菌丝生长。在这方面，A. pellucida POE182 、 链格孢菌 CAE92, CSE177 和CSE165是最有效的菌株。然而A