酶促反应动力学实验

1、文档编码 : CJ8D2A2I4R4 HP9S7E3J3H9 ZI4D1X1N7J9酶动力学综合试验 试验（一）碱性磷酸酶 Km值的测定【目的要求】1.明白底物浓度对酶促反应速度的影响2.明白米氏方程、 Km 值的物理意义及双倒数作图求【试验原理】Km 值的方法；1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中,其中以肝脏为最多；其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织；但它不是单一的酶,而是一组同功酶；本试验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的；2、米氏方程：Michaelis-Menten 在争论底物浓度与酶促反应速度的定量关系时,应动力学的基本公式,即：错误！未找到引用源；导出了酶促反 1

2、式中： v 表示酶促反应速度,错误！未找到引用源； 表示酶促反应最大速度,S表示底物浓度,错误！未找到引用源； 表示米氏常数；3、错误！未找到引用源； 值的测定主要接受图解法,有以下四种：双曲线作图法（图 1-1,a）依据公式（ 1）,以 v 对s作图,此时 1/2 错误！未找到引用源；时的底物浓度 s值即为 Km 值,以克分子浓度（ M）表示；这种方法实际上很少接受,由于在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和；实测 错误！未找到引用源； 一个近似值,因而 1/2 错误！未找到引用源； 不精确；此外由于 v 对S的关系呈双曲线,试验数据要求较多,且不易绘制； Lineweaver- Burk作

3、图法双倒数作图法（图 1-1,b）实际工作中,常将米氏方程（式（1）作数学变换,使之成为直线形式,测定要便利、精确得多； 其中之一即取 （1）式的倒数, 变换为 Lineweaver- Burk方程式：错误！未找到引用源；2 以错误！未找到引用源； 对错误！未找到引用源； 作图,即为 y=ax+b 形式；此时斜率为 错误！未找到引用源；,纵截距为 错误！未找到引用源；把直线外推与横轴相交,其截距相交,其截距即为错误！未找到引用源； ；Hofstee 作图法（略）把（ 2）式等号两边乘以 错误！未找到引用源； ,得：错误！未找到引用源；3 以 v 对错误！未找到引用源； 作图,这时斜率为 错误！

4、未找到引用源； ,纵截距为错误！未找到引用源； ,横截距为 错误！未找到引用源； ；Hanas作图法（略）把（ 2）式等号两边乘以 S,得：错误！未找到引用源；4 以 对s作图,这时斜率为 错误！未找到引用源； ,纵截距为 错误！未找到引用源；（a）b 本试验主要以双倒数法,即Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶Km 值；具体原理如下：本试验以碱性磷酸酶为例, 用磷酸苯二钠为其作用物, 碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下（PH10.0,和 60）,精确反应13 分钟；在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长 色泽深浅与光密度成正比；反应式如下：620

5、nm 比色；在确定条件下然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度,即以光密度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶Km值；【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴2. 721 型分光光度计试剂：1 酚试剂：称钨酸钠（ 错误！未找到引用源；W 错误！未找到引用源； 2 错误！未找到引用源； O）100g,钼酸钠（ 错误！未找到引用源； Mo 错误！未 找到引用源； 2 错误！未找到引用源； O）25g 置 1500mL 磨口回流装置内,加蒸馏水 700mL,85%磷酸 50mL 和浓硫酸 100mL；充分混匀,使其溶解；小 火加热,

6、回流 10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防溶液溢出）,再加入硫酸锂（LiSO4）150g,蒸馏水 50mL 及液溴数滴；在通风橱中开口煮沸 15min,以除去余外的溴；冷却后定容至1000mL,过滤即成,此液应为鲜黄色,不带任何绿色；置棕瓶中,可在冰箱长期储存；如此贮存液使用过久,颜色由黄变 绿,可加几滴液溴,煮沸几分钟,复原原色仍可连续使用；使用时用蒸馏水 稀释一倍,最终酸度为 1N；2 2.5mM 磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（ C6H5PO4Na2.2H2O）,溶于 1,000ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,加数滴夜溴以防腐,置冰箱 内可储存一年之久；3 碱性缓冲液（ p

7、H10.0）： 称取无水碳酸钠 6.36g及碳酸氢钠 3.36g,溶解于蒸 馏水中,并稀释至 1,000ml. 4 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶【试验步骤】取 6 支试管按下表加入试剂：1mg,加水 34ml,冰箱内可储存五周左右；2.5mM 磷酸苯二1 2 3 4 5 6 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 钠（ ml）0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1 蒸馏水（ ml）碱性缓冲液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （ml）混匀后, 60欲温 5 分钟碱性磷酸酶液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - （ml）混匀后, 60水浴 13 分钟（精确计时）留意

8、 ：1）加入碱性磷酸酶液要快速、精确；用移液枪加酚试剂（ ml）2）此时为酶促反应,总体积2.1ml 1.0 1.0 3）第六管不加酶；1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na2CO3ml3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀后,室温放置 15 分钟 留意 ：1）酚试剂为显色剂,同时为酶的变性剂,故加入酚试剂后酶促反应即停止；2）Na2CO3 供应碱性环境,加入 以 6 管为调零点,在 620nm 波特长比色；【结果处理】1 将各管光密度和底物浓度记入下表Na2CO3 后试剂才显色管号O.D 1/O.D S 1/S 1 2 3 4 5 2 以 1/O.D 为纵坐标, 1/s 为

9、横坐标,按 Lineweaver- Burk作图,求出碱性磷酸酶 的 Km 值；【留意事项】1） 加入碱性磷酸酶的量要精确 2） 保温时间要精确精确保温的方法：从第一管加入酶液开头计时,每隔1 分钟向下一只试管加酶液,直至加完,到精确 13 分钟马上向第一管加酚试剂,以终止其反应,并每隔 1分钟向下一只试管加酚试剂 ,直至加完止,这样保证每管精确保温 13 分钟；【摸索题】1） Km 的意义及其影响因子2） 为什么酶促反应速度以初速度表示3） 为什么 O.D 可直接代替 V 作图4） 分析自己的试验数据试验（二）温度对酶活性的影响【试验目的】明白温度对酶活性及酶促反应速度的影响,加深对酶特性的

10、熟识；【试验原理】每种酶都有其最适温度, 高于或低于此温度酶的活性都降低；一般而言, 如酶处于过高的温度环境中, 会使酶活性永久丢失； 而如处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制,一旦温度适宜,酶又会全部或部分的复原其活性；【仪器与试剂】仪器：1冰箱2.恒温水浴锅3.试管和试管架4吸量管及吸量管架5.移液枪及枪头6.胶头滴管7烧杯试剂：1PH6.8 的缓冲液：量取 混合摇匀即可；15.45ml 的 0.2M 磷酸氢二钠和 4.55ml 的柠檬酸20.5% 淀粉的 0.5% 氯化钠溶液：0.5g 可溶性淀粉和 0.5g 氯化钠,溶于 100ml 蒸馏水（需加热）；3003175g/L 碘液41

11、M HCl 溶液5.1M NaOH 溶液6.稀释 100 倍的唾液7.冰水浴【试验步骤】1制管和预温 由于本试验对恒温反应要求较高,故每个温度梯度使用两支试管, 分别标记为 A 管和 B管,同时欲温底物与酶； A 管加入 PH6.8 的缓冲液和 0.5%淀粉液； B 管使用移液枪加入稀释 100 倍的唾液,相对应的两支试管置于设定的温度下预温 5min；取 12 支洁净试管,参照下表加入试剂：A 管号1（0） 2（室温） 3（37） 4（50） 5（70） 6（室温）PH6.8的2 2 2 2 2 2 缓冲液（ml）用 2ml含 NaCl的 0.5%2 2 2 2 2 的蒸馏淀粉液水代替（ml

12、）B 稀释 1001 1 1 1 1 1 倍的唾液（ml）替*6 号管为对比组（比色时作为0 号管）,置于室温,且淀粉液用蒸馏水代2混合 A、B 管将 1 号 A 管试剂快速加入温度对应的B 管中 为了最大限度保证酶的量 ,此时为计时的起点（使用秒表） ,摇匀后放回对应温度连续水浴；留意：转移 A 管 试剂前需将其摇匀；3时间把握然后每隔 1min 或 2min（时间自定）按上步操作依次把 A、B管混合 ,严格把握好时间；2、3、4、5、6 号的4中止反应精确反应 13min,向 1 号管加入 2 滴 1M HCl 溶液,马上混匀,中止反应,按上一步的次序和时间间隔依次对各管进行操作,并移至试

13、管架；后再各用2滴 1M NaOH溶液中和每管；5显色在每管中各加入 2ml 0.03175g/L 6比色碘液并混匀,观看现象；如不同温度梯度间现象差别不明显,就进行比色,通过光密度值来比较；【结果处理】记录现象（或比较吸光度值） ,做出合理分析；【留意事项】严格留意时间的把握及各物质的添加量；【摸索题】假如某同学 （没有严格依据教案步骤） 做出的试验结果为唾液淀粉酶的最适温度 为 70 度,请分析他得出这样的结果的可能缘由；试验（三） PH对酶活性的影响【试验目的】明白 PH对酶活性及酶促反应速度的影响,加深对酶特性的熟识；【试验原理】 1.PH 对酶活性影响的机理： PH影响酶活性中心的某

14、些必需基团的解离 , 而这些 基团往往仅在某一解离状态时才最简洁同底物结合或具有最大催化活性；PH 影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态, 从而影响酶对他们的亲和力； PH仍可以影响酶活性中心的空间构象 , 从而影响酶的活性； 2. 本试验用唾液淀粉酶为材料来观看酶活性受PH的影响的情形；淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而显现不同程度的水解 , 从而得到各种糊精乃至 麦芽糖 , 少量葡萄糖等水解产物；碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应显现 不同颜色 , 即淀粉 蓝色 、紫色糊精 紫色 、红色糊精 红色 、麦芽糖及少量葡 萄糖 黄色 ；【仪器与试剂】仪器：1、冰箱2、电炉3、恒温水浴锅4、试管架及试管5、移液管架及移液管试剂：1、0.2M 磷酸氢二钠溶液：称取 定容至 1L；35.61g 含 2 个结晶水的磷酸氢二钠,用水2、0.1M 柠檬酸溶液： 称取 21.01g 含一个结晶水的柠檬酸, 用水定容至 1L；3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释 的酶液、10 倍、50 倍和 100 倍,得三种不同浓度4、0.5% 淀粉的 0.5% 氯