酱油渣源副干酪乳杆菌体外安全性评价

1、酱油渣源副干酪乳杆菌体外安全性评价酱油是我国传统的调味品，据智研咨询发布的20222027年中国酱油行业发展现状及发展趋势预测报告中报道，2022年中国酱油产量达700.8万t。酱油渣是酱油酿造过程中的副产物，每生产1 kg酱油产生含水约75%的酱油渣0.67 kg1，即每年产生的酱油渣会超过469万t，而酱油渣中含有20%30%的粗蛋白，23%左右的粗纤维，10%以上的碳水化合物等，若处理不当是资源的巨大浪费，也会对环境造成一定程度的污染。因此，对酱油渣的处理及利用是酱油工业发展中急需解决的问题之一。近年来，酱油渣的开发和应用较多，如用作动物饲料、制备生物絮凝剂、提取生物活性化合物等，也有通

2、过接种特定微生物，再次发酵酱油渣，以有效降解原料中潜在有害物质，且转化大量基质为有用产品，进而改善酱油渣品质的研究2。副干酪乳杆菌是乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，广泛存在于发酵食品和人的口腔及肠道内，在食品、医疗保健领域发挥重要作用，特别是其作为商业发酵剂具有良好的发酵特性和研究价值3。如：POVEDA等4利用副干酪乳杆菌发酵奶酪，可促使奶酪中游离脂肪酸和醇类物质增加，风味有明显提升。也有研究认为，部分副干酪乳杆菌具有一定致病性，能引起败血症、心内膜炎和局部感染等疾病5。由此可见，若副干酪乳杆菌作为发酵剂使用于食品，则对其进行生物安全性评价与研究尤为必要。本实验室前期从酱油渣中分离鉴定得到6株副干

3、酪乳杆菌，这些菌株具有良好的生长及抗氧化特性6-7，但尚不了解其生物安全性。因此，本研究拟通过药敏实验、质粒提取实验、吲哚实验、溶血实验、氨基酸脱羧酶实验等，对已分离得到的上述6株菌的体外生物安全性进行分析与评价，以充分挖掘利用酱油渣中的副干酪乳杆菌资源，以期为减少酱油渣资源浪费、再次应用于酱油渣发酵或饲料生产等提供科学依据。2.2 有害代谢产物评价2.2.1 吲哚实验结果与分析吲哚实验可检测菌株能否产生色氨酸酶，其分解色氨酸后能生成吲哚。色氨酸是人体必需氨基酸，其代谢失调会影响色氨酸的吸收，甚至影响免疫及消化功能，引起神经系统功能障碍等。吲哚实验结果见表4。6株副干酪乳杆菌的吲哚实验结果均为

4、阴性，而对照菌株大肠杆菌的结果为阳性，说明6株副干酪乳杆菌不能产生色氨酸酶，不会引起吲哚类物质的产生。这与王英等20的副干酪乳杆菌的吲哚实验结果一致。2.2.2 溶血实验结果与分析溶血是指细菌分泌的溶血素使细胞溶解的现象，与菌株自身致病性相关。许多革兰氏阳性菌和阴性菌都能产生溶血素，作用于细胞膜后造成其结构和功能紊乱，使细胞内成分泄露，从而导致细胞死亡。根据溶血情况可分为3类：-溶血，是指血平板菌落周围呈现棕绿色，这类菌通常为条件致病菌；-溶血，是指菌落周围出现无色透明圈，这类菌通常具有强致病性，如金黄色葡萄球菌；-溶血，是指菌落周围显示正常血平板颜色，这类菌通常没有致病性21。溶血实验结果见

5、图2和表4。6株副干酪乳杆菌均有溶血性，其中表现为轻微溶血的菌株有2株，分别是HT31和HT111。副干酪乳杆菌HT197为无色透明圈的-溶血，被摄入人体后可能有产生败血症的风险，因此，不能作为发酵菌株。乳酸菌出现-溶血的情况较少，此前IBRAHIM等22在埃及发酵乳制品中分离的乳酸菌中也发现了1株乳酸菌为-溶血。副干酪乳杆菌HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均为呈棕绿色溶血圈的-溶血，乳酸菌产生-溶血的情况比较常见，BIN等23从多个发酵乳及牛乳中分离的乳酸菌中有30%的菌株出现了-溶血，MARAGKOUDAKIS等24对干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的溶血实验研究发现小部分菌

6、株会出现-溶血现象，因其没有出现致病性高的-溶血，故上述研究者认为这类菌株是相对安全的。由此可以得出，本实验中出现-溶血的HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均相对安全。表4 实验菌与对照菌的有害代谢产物评价结果Table 4 Evaluation results of harmful metabolites of experimental and control bacteria注：-阴性；+-阳性，+的数量表示程度；/-没有进行该实验a-HT31；b-HT197；c-S.aureusATCC 25923图2 溶血实验结果图Fig.2 The results of hemo

7、lysis test2.2.3 氨基酸脱羧酶实验结果与分析氨基酸脱羧酶实验可以检测菌株分解氨基酸生成生物胺的能力。精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸经过氨基酸脱羧酶作用后分别形成精胺、尸胺和腐胺，过多的生物胺类物质积累会引起许多副作用，如呕吐、恶心、发烧等症状13。此外，各生物胺之间还可以通过抑制某些生物胺相关代谢酶的活性，使生物胺数量增加，进而增强人体的不适症状。氨基酸脱羧酶实验结果见表4。6株副干酪乳杆菌的精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶实验均呈阴性，对照菌株大肠杆菌呈阳性，说明这6株菌不产生氨基酸脱羧酶，对人体无害。此结果与徐传标等25的干酪乳杆菌的氨基酸脱羧酶实验结果一致。3 结论与讨论本研究通过药敏

8、试验、质粒提取实验、溶血实验、吲哚实验和氨基酸脱羧酶实验，从耐药性检测和有害代谢产物研究两个方面对酱油渣中分离的6株副干酪乳杆菌体外安全性进行评价。对菌株抗生素耐药性的测定，是对现有的和潜在的益生菌菌株体外安全性评估的重要内容之一。本研究采用纸片扩散法探究了6株副干酪乳杆菌对青霉素、头孢噻吩、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、复方新诺明、氯霉素的敏感情况，结果表明，6株菌均对庆大霉素、复方新诺明表现为耐药，HT31、HT90、HT155、HT159、HT197对青霉素、头孢噻吩、红霉素、氯霉素敏感，对环丙沙星中度耐药，HT111对青霉素、头孢噻吩、红霉素、氯霉素、环丙沙星敏感，原因可能是副干酪乳杆菌

9、对抑制细胞壁合成酶和蛋白质合成的药物较为敏感15-16。抗生素耐药基因可通过质粒在食品和肠道环境中发生转移，通过质粒提取实验探究6株副干酪乳杆菌是否有携带耐药基因的质粒存在，结果表明，6株菌均不存在携带耐药基因的质粒，与之前多篇文献研究结果一致19-20。综上，6株副干酪乳杆菌对2种抗生素表现为抗性(庆大霉素、复方新诺明)，其中HT31、HT90、HT155、HT159、HT197对4种抗生素敏感(青霉素、头孢噻吩、红霉素、氯霉素)，对1种抗生素中度耐药(环丙沙星)，HT111对5种抗生素敏感(青霉素、头孢噻吩、红霉素、氯霉素、环丙沙星)，且均不携带耐药质粒。菌株的安全性研究还需对其毒性代谢产

10、物的产生予以重视。本研究通过吲哚实验、氨基酸脱羧酶实验、溶血实验探究了6株副干酪乳杆菌毒性代谢产物的生成情况，结果表明，6株副干酪乳杆菌均不产生色氨酸酶和氨基酸脱羧酶，不会产生吲哚、精胺、尸胺和腐胺等有害物质，与之前副干酪乳杆菌相关有毒代谢产物研究的结果一致20,25，HT197出现-溶血现象，此前也有研究发现从发酵食品中分离的乳酸菌会产生-溶血22，产生这种溶血现象的菌株安全性较低，有引起败血症等疾病的风险5，其他5株菌均未出现-溶血现象。综上，6株副干酪乳杆菌在耐药性检测、产有害代谢物吲哚、精胺、尸胺和腐胺方面相对安全，在溶血方面，HT197为-溶血，而其余5株菌没有出现-溶血，因此认为这5株菌具有良好的安全性。当前，解决酱油渣资源浪费问题的研究主要集中在提取其中附加值较高的物质或用作动物饲料方面，对酱油渣中微生物的开发利用尚不足。酱油渣是酱油发酵的副产物，微生物种类丰富，从中筛选出性能良好并安全的菌株用作发酵剂能很大程度改善酱油渣的品质和安全性，