碳纳米管作为载体在生物医学中的应用

1、碳纳米管作为载体在生物医学中的应用【摘要】碳纳米管是一种新型的纳米材料，随着对碳纳米管功能化研究的深化，碳纳米管在生物医学领域的应用也在拓展。本文就其作为载体携带多肽、蛋白质、核酸、疫苗和药物进入细胞发挥生物医学作用作一综述。【关键词】碳纳米管载体生物医学碳纳米管arbnnantube，NT是由日本NE公司的Iijia于1991年发现的新型纳米材料，由碳原子形成的石墨片绕中心轴按一定的螺旋角卷曲而成的无缝、中空的管体。管子一般由单层single-alledNT，SNT或多层ulti-alledNT，NT组成。由于NT具有良好的力学、电磁学和化学性能，目前在物理、化学和材料科学中已成为研究前沿，

2、并在很多领域有了探究性的应用，如场致发射、能量储藏、分子电极4、原子力显微镜等，但其不溶于任何溶剂的特性限制了其在生物医学中的应用。进步NT的分散性和溶解性的方法主要分为两大类：第一类是非共价结合外表活性剂、核酸、多肽、多聚物或寡聚体；另一类方法是NT的共价功能化，通过浓酸氧化截短或环加成作用在其外表或顶端连接有机分子，通过侧链分子间的互相排挤作用使其分散与溶解。对NT进展改性的过程称为NT的功能化，功能化NT可以进入细胞，并且其共价连接的侧链可以进一步与生物分子，如多肽、蛋白质、核酸以及药物等相结合；而且NT本身就可以非共价结合多肽、蛋白质或核酸作为功能化的修饰基团，以上2个条件可使NT成为

3、载体并在生物医学领域广泛应用。1功能化NT进入细胞的机制荧光标记的胺基化NT0.05g/L与人早幼粒白血病细胞huanleukeianline，HL60在37共培养1h后，应用荧光显微镜可以看到细胞外表有较多的荧光聚集，更为重要的是细胞内也可看到荧光，这说明功能化的NT能进入细胞内。异硫氰酸荧光素fluresEinisthiynate,FIT标记的胺基化NT主要分布于细胞质，进入细胞核较慢；而肽结合的NT可以快速的进入细胞核。目前有关功能化NT进入细胞的机制尚有争论，普遍认为有被动吞噬和主动穿透两种可能途径。Ka等将FIT绿色荧光标记的胺基化SNT与HL60细胞共培育后，再用内含体特异的红色荧

4、光标记物将内含体染色，荧光显微镜可以观察到细胞内红、绿两种颜色叠加的黄色荧光标记物，提示功能化NT是通过细胞内吞作用进入细胞的。降低共培养温度至4细胞内就没有荧光，提示低温能抑制细胞内吞作用。进一步的研究说明NT携带生物分子进入细胞是通过网格蛋白依赖性细胞内吞途径，而与细胞膜内陷途径无关。Bttini等研究也认为NT是通过细胞内吞作用进入Jurkat细胞的，而且可以被D3受体介导的细胞内吞作用放大，但不进入细胞核。而Pantartt等将胺基化SNT2.5g/L与HeLa细胞共培育1h后以环氧树脂包埋制成超薄切片，通过对连续切片的细致观察可以看到NT穿过细胞膜的过程，所以认为有一定刚性和长度的N

5、T并非通过细胞内吞作用进入细胞，而是象一根针一样主动地刺穿细胞膜进入细胞而不引起细胞的损伤。Bian等也认为可以排除细胞内吞作用，因为应用叠氮化钠或2,4二硝基酚抑制细胞内吞作用或降低培养温度至4，并不能抑制细胞摄入不同的NT。最近的分子动力模型数据显示疏水的NT连接亲水基团后可以主动地插入脂质双分子层。功能化NT进入细胞的不同机制和在细胞内的不同分布也许取决于NT的不同功能化基团。2功能化NT作为不同生物分子或药物进入细胞的载体2.1多肽、蛋白质螺旋形的多肽具有两性分子的特点，因此可以通过疏水作用与NT结合形成可溶性的超分子聚合物13，功能化的NT带正电荷的侧链也可以通过正负电荷引力结合多肽

6、或蛋白质。原子力显微镜可以直接观察到蛋白质在功能化NT外表的聚集，蛋白质单体在NT外表的间距约为20100n，Ka等14形象地将其描绘为“麦穗样构造。通过比拟细胞色素、牛血清白蛋白蛋白质A与羧基化NT的结合图像，发现细胞色素的聚集最多，而其等电点约为9.2，另外两个蛋白质的等电点均7，所以认为蛋白质与NT之间的非共价结合除了疏水作用外，静电引力是另外一个重要的作用。通过生物素将具有荧光的抗生物素蛋白链菌素连接于胺基化NT并与HL60细胞共培育，在肿瘤细胞内发现有较强的抗生物素蛋白链菌素荧光，提示NT能将大分子蛋白载入细胞内。通过流式细胞分析发现随着NT浓度和培养时间的延长，进入细胞内的NT及抗

7、生物素蛋白链菌素的量不断增加7，对照研究说明蛋白质本身不能进入细胞，在这里功能化的NT起蛋白质载体作用。功能化SNT通过生物素连接抗生物素蛋白链菌素并与HL60细胞共培育，12h后即可在光学显微镜下看到大量的细胞碎片，提示细胞死亡。将连接的抗生物素蛋白链菌素的量从2.5l减少到0.0625l，结合物的细胞毒性也相应降低，说明功能化SNT不但能将蛋白质载入细胞内，而且连接的蛋白质还能发挥原有的剂量依赖性的生物学功能。细胞色素也能连接于羧基化SNT进入细胞，并能保存其生物学活性而导致细胞的凋亡，但其是否从NT上脱落下来而发挥生物学作用尚需进一步研究14。2.2DNA单链DNA可以非共价结合于SNT

8、，并使NT分散于水和培养基中，以y3荧光标记DNA后显示SNT可以携带DNA进入细胞，但大局部分布在细胞质中，只有少量能进入细胞核。目前利用DNA作为NT稳定剂的研究都是在液相中进展的，并都需要超声振荡处理。而Nepal等的研究是在固相中将NT和DNA一起碾磨即应用机械化学反响将NT截短与DNA结合形成长短相对均一、水溶性良好高达5.6g/L且长期稳定可以长达6个月的SNT-DNA或NT-DNA超分子化合物。的互相作用使DNA和NT骨架结实结合，而位于外表的DNA磷酸根使聚合物溶解于水。同时碾磨作用并没有改变DNA或NT的固有特性。当720g/L的胺基化SNT和5g/L的质粒相混电荷比为6:1

9、，透射电子显微镜下可以直观地看到NT外表有球形、环形或螺旋形质粒的聚集。凝胶电泳显示带正电荷的胺基化的NT可以结合带负电荷的质粒，而带负电荷或不带电荷的羧基、羟基或烷基修饰的NT那么不能结合质粒。Kaiser试验也显示胺基化的NT的修饰侧链数量到达0.934l/g，说明胺基化NT外表有高密度的正电荷，并通过正负电荷作用与质粒结合17。外表胞质基团磁共振surfaeplasnresnane,SPR显示胺基化的NT和质粒间有较强的亲和力，由于较强的电荷之间的互相吸引而形成比拟稳定的超分子构造，并且说明NT可以比SNT浓聚更多的质粒，扫描电子显微镜从形态学上也证实这一点。电荷比为1:1时胺基化的NT

10、可以浓聚96的质粒，而胺基化的SNT仅能浓聚43的质粒，当电荷比到达6：1时，NT可以浓聚99的质粒而SNT是58。原因是两者在电荷密度相似的条件下NT有更大的外表积，并且扫描电子显微镜显示质粒与其结合更为严密和结实18。胺基化NT可以携带有绿色荧光蛋白greenfluresentprtEIn,GFP报告基因的质粒转染人脐静脉内皮细胞和人黑色素瘤细胞株A375，比照不同电荷比的转染效率，发现胺基化NT与质粒的电荷比为10:2时，转染效率最高17。Pantartt等11的研究结果也显示功能化SNT和DNA的电荷比介于2:16:1时，基因转染效率最高，为单独DNA对照的510倍，并且转染时间以3h

11、为最正确。但目前功能化NT转染基因的效率仍低于lipfetaine的转染效率。ai等设计了包埋有镍的带磁性的功能化NT，旋转磁场可以使磁性NT黏附于细胞外表，然后在固定磁场的作用下，NT可以穿入细胞。这种磁性功能化NT在旋转和固定磁场的序贯作用下可以携带有GFP报告基因的质粒体外转染小鼠神经元细胞和B淋巴细胞，转染效率通过流式细胞定量分析和荧光显微镜定量分析可以到达80100。原代的B淋巴细胞和神经元细胞以难转染而著称，这两种细胞应用lipfetaine携带一样质粒转染均未成功。功能化NT的另一显著优势是没有细胞毒性，噻唑蓝试验显示高达60g/L的胺基化NT并不影响细胞的生长，而lipfeta

12、ine20g/L就显示出细胞毒性。2.3RNA小分子RNA干扰RNAinterferene，RNAi是一种新的基因治疗技术，是双链RNA分子siRNA在RNA程度关闭相关序列基因或使其沉默的过程，较以往的核酶和反义核酸技术更能高效、特异地阻抑基因的表达。功能化NT带正电荷的侧链不但可以介导NT与蛋白质、DNA的连接，还可以介导siRNA与NT的结合。特定的siRNA可以通过二硫键连接于功能化NT的侧链并以功能化NT为载体进入细胞，在二硫苏糖醇的作用下二硫键断裂，使siRNA从NT载体上游离下来，并从内含体或溶酶体中释放出来而分布于细胞质或进入细胞核发挥RNA干扰作用，抑制层连蛋白lainA/的

13、表达。流式细胞定量分析显示以该载体转染细胞的RNA干扰效率明显高于lipfetaine载体的效率。可能与NT的高比外表积、高效的转运才能及可裂解的二硫键防止了生物学活性分子在溶酶体内的降解破坏有关。端粒酶是维持细胞染色体稳定的关键酶，端粒酶的激活与肿瘤形成有关，在大多数肿瘤中都能检测到端粒酶逆转录酶telerasereversetransriptase,TERT的存在，宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞都高表达TERT信使RNA和蛋白。胺基功能化带正电荷的SNT可以介导TERTRNAi进入肿瘤细胞，抑制TERT基因的转录和表达，产生特异性的RNA干扰作用。共培养48h后就可以明显看到肿瘤细胞凋亡

14、的形态学改变：细胞生长停滞、形态增大、细胞质空泡化。共培养6d后，还可以明显地抑制肿瘤细胞的生长。在小鼠移植瘤内注射TERTsiRNA+SNT可以明显抑制移植瘤的生长，且多点注射较单点注射效果明显。树突细胞是最有效的抗原呈递细胞，并在有效免疫反响的启动中发挥中心作用。抗肿瘤免疫的失效被认为是树突细胞内存在信号系统控制的免疫抑制机制。因为细胞吞噬作用可能是NT进入细胞的主要机制，所以Yang等假设静脉内应用NT能被抗原呈递细胞摄龋通过鼠尾静脉注射DNA功能化的NT后，在脾脏的树突细胞内可以观察到NT的存在。通过鼠尾静脉注射D80siRNA+SNTs+复合物可以显著减少D11+的树突状细胞和D11

15、b+的巨噬细胞外表D80分子的表达，说明D80siRNA+:SNTs+复合物不但能被肿瘤相关性Gr-1+D11b+的树突状细胞摄取，而且可以产生特异性的RNA干扰作用；同时siRNA+SNTs+复合物并不影响树突状细胞的表型和形态，说明siRNA+SNTs+复合物不影响树突状细胞的分化和功能，这就为RNA技术在肿瘤免疫治疗中的应用提供了理论基矗静脉应用SS1细胞因子信号1抑制因子suppressrfytkinesignaling1，SS1siRNA+SNTs可以特异性地干扰SS1的表达，从而增强树突细胞的抗原呈递功能继而延缓肿瘤的生长。转贴于论文联盟.ll.2.4疫苗因为NT具有较高的长径比，

16、能提供较大的外表积，具有较大的生物分子结合才能，所以被认为是多肽抗原的理想载体。人工合成的口蹄疫病毒抗原通过一段肽链连接于NT后，仍可以保存其抗原性和免疫原性，通过酶联免疫吸附试验，可以明确结合于NT的肽保存了其原有的构造特点并能为特定的抗体识别；Bian等8将上述口蹄疫病毒抗原肽链-NT复合物接种小鼠，并与病毒单独接种比拟，发现复合物可以增强相应抗体的产生，并且抗体是病毒抗原特异性的，并不与连接肽和NT反响。同时发现要将病毒抗原共价连接于NT才能产生高滴度的抗体，将抗原与NT简单相混并不能刺激产生高滴度的抗体。更为重要的是NT本身并不刺激产生抗体，即NT没有抗原性，与蛋白质载体比拟防止了反复

17、应用可能导致的抗原表位抑制。2.5药物设计药物载体的目的是克制或改善药物单独应用的某些缺点，如溶解度低、组织分布差、缺少选择性、药物动力学差或损害安康组织等，用以进步药物的动力学和治疗效果。Feazell等将顺铂的前体铂复合物通过肽链连接到胺基化SNT，以胺基化NT为载体并通过细胞的内吞作用，铂复合物能进入睾丸癌细胞，并且连接于功能化NT外表的铂复合物的细胞毒性是游离复合物的100多倍，为进步肿瘤化学治疗药物的敏感性提供了一条新途径。另外，NT的较高的长径比使在同一根NT可以同时连接不同作用的分子成为可能靶向分子、报告分子、药物、增敏分子等。u等将荧光标记物FIT和抗真菌药物两性霉素B同时连接

18、于功能化NT，前者可以作为细胞摄取NT的追踪剂，后者搭载NT很容易进入细胞，并保存了较强的抗真菌活力。Zhu等发现碳硼烷修饰的水溶性SNT静脉注射后可以选择性地在肿瘤组织中浓聚、滞留，静脉应用48h后肿瘤组织中的浓度为血液中浓度的3.12倍，所以NT可以成为硼中子俘获疗法治疗肿瘤的载体。2.6其他生物系统对7001100n的红外线几乎是完全通透的，但SNT可以强烈吸收该波段的光线，这一源于NT的电学特性在载体系统中是独一无二的。在红外线的照射下，通过内吞作用进入细胞内的y3-DNA-SNT可以吸收光能产热，导致内含体的破裂，并使y3-DNA-SNT从SNT游离下来，移位进入细胞核。限制照射时间

19、10s并不会对细胞活力和细胞增殖才能产生不良影响；延长照射时间至2in可以导致细胞损伤，并有细胞形态学改变如黏附力的下降、细胞碎片的聚集；而没有NT的对照组细胞完全不受红外线照射的影响。在SNT外表连接叶酸就可以选择性地介导NT进入叶酸受体阳性的肿瘤细胞，然后在红外线的照射下特异地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有不良影响。结合应用NT运载才能及光学特性，可以开拓药物递送和肿瘤治疗的新领域。3NT的生物平安性Bian等认为NT的生物毒性主要是由残留的催化剂和不溶性引起的。不溶性的原始的NT对细胞的毒性在共培养24h就开场显现，5d后更为明显。细胞毒性的形态学表现为培养1d后局部细胞在培养皿中由严密

20、贴壁变为疏松粘连或脱离，剩余的细胞表现为细胞质收缩，细胞核皱缩和嗜酸性改变，这些形态学的改变标志着细胞不可逆的损伤和细胞死亡的开场。ui等从基因和蛋白程度阐述了NT的细胞毒性，NT抑制人肺癌细胞株HEK293细胞的增殖是通过p16-ylinD-Rb途径实现的。HEK293细胞在NT的刺激下，p16蛋白的积聚可以结合并抑制细胞周期蛋白DK2、DK4、DK6的活性，从而阻止细胞进入S期，而停滞在G1期，并且与黏附有关的蛋白如：层粘连蛋白、FAK、钙黏蛋白、细胞周期蛋白D3表达量也逐渐下降，表现为细胞黏附力的下降。虽然NT进入细胞机制需要进一步的研究和统一，但目前的报道都一致认为功能化良好、水溶性强

21、的NT没有明显的细胞毒性-。Sayes等的研究说明随着NT侧壁功能化程度的增加，细胞毒性会减少。Durtier等认为功能化NT除了没有细胞毒性外，对免疫细胞的功能也没有明显的影响。4结语NT的制备如今已经产业化，随着对其功能化研究的深化，有望进一步改善其生物相容性。说明NT进入细胞的机制并明确其运载效率的影响因素将进一步拓展其作为载体在生物医学领域中的应用。【参考文献】1IijiaS.HelialirtubulesfgraphitiarbnJ.Nature,1991，3546348：56-58.2ilneI，TeKBK，AaratungaGAJ，etal.arbnnantubesasfield

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