表没食子儿茶素没食子酸酯测定及其对胃癌细胞增殖的抑制作用研究

1、表没食子儿茶素没食子酸酯测定及其对胃癌细胞增殖的抑制作用研究【摘要】目的分析表没食子儿茶素没食子酸酯(EGG)在绿茶提取物中的含量，讨论EGG对人胃癌细胞BG823增殖和凋亡的影响，为说明EGG抗肿瘤作用机制提供实验基矗方法反相高效液相色谱法(RP-HPL)测定绿茶提取物中EGG的含量。TT法检测EGG对体外培养的人胃癌细胞BG823增殖的影响;DNAladder法检测EGG处理各组DNA梯度的变化。所有数据均采用SPSS12.0进展统计分析，均数比拟采用t-test。结果通过绘制标准曲线确定绿茶提取物中EGG的含量为9%。TT法检测结果显示EGG可以呈现剂量(510-3,110-2,210-

2、2,410-2)g/L依赖性地抑制人胃癌细胞BG823的增殖;DNAladder法显示EGG处理组细胞DNA呈现梯状条带，而对照组那么没有这种带纹。结论绿茶提取物中EGG的含量为9%;EGG可以通过诱导细胞凋亡而抑制人胃癌细胞BG823的生长和增殖。【关键词】反相高效液相色谱;表没食子儿茶素没食子酸酯;胃癌细胞;细胞凋亡Abstrat：bjetiveTanalyzethententfEpigallatehingallate(EGG)ingreenteaextratinandtinvestigatetheeffetfEGGntheprliferatinandapptsisfhuangastria

3、nerellsBG823ulturedinvitr,hihprvideexperientalbasisfrlarifyingtheehanisfantitureffetfEGG.ethdsInthenditinfbilephasedubledistilledater/aetnitrile/ethylaetate(86122v/v/v),aflratef1.0l/in,RP-HPLhratgraasusedtstudyEGGingreentea.HuangastrianerellsBG823ulturedinvitreretreatedithdifferentnentratinsfEGG,and

4、thentheabsrbenynat490nftheellsineahgrupasexainedbyTTethd.DNAladderassayasusedtdetettheapptsisfBG823.StatistialanalysisasperfredbySPSS12.0andttestasusedtparetheeanvaluebeteenthedifferentgrups.ResultsThereas9%EGGingreenteaextratinalulatingbydraingstandardure.AftertreatentithdifferentnentratinsfEGG,ase

5、asuredbyTTassay,ellviabilitydereasedinadse-(510-3,110-2,210-2,410-2g/L)dependentanner(shedasfigure2).DNAladderassayshedthatDNAftheellstreatedithEGGshedtheharateristisfapptsis-DNAladder,hilethentrlgrupdidnthavesuhstrip.nlusinThereas9%EGGingreentea.EGGaninhibitthegrthandprliferatinfgastrianerellsBG823

6、byinduingitsapptsis.Keyrds：RP-HPL;EGG;Gastrianerell;ellapptsis历史上茶曾被作药用。近些年,茶及其组分对人体安康的潜在好处使得对茶的研究越来越广泛。茶尤其是绿茶，含有特殊的多酚物质,主要是儿茶素1。儿茶素是以儿茶为主体构造,与没食子酸基团结合形成的一类活性物质,其中表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallatehingallate，EGG)是绿茶儿茶素中含量最高的一种,占50%左右，其它几种茶多酚化合物在绿茶中的含量相对较低,包括表没食子儿茶素(epigallatehin,EG)、表儿茶素没食子酸酯(epiatehin-3-galla

7、te,EG)和表儿茶素(epiatehin,E)2。研究说明3，4,EGG具有很强的抗肿瘤生长、抗癌侵袭转移等活性。此外,它也用作肿瘤多重耐药性的逆转剂,可以改善许多癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性5。据此我们推测EGG可以抑制细胞增殖从而抑制胃癌细胞的生长，在胃癌治疗中发挥有益的作用。我们研究日照绿茶中EGG的含量及其对胃癌细胞增殖的抑制作用，以期讨论绿茶是否也有着广泛的生物学作用，为进一步开发绿茶的应用价值提供根底资料。1材料与仪器BG823细胞株(山东省医学科学院);EGG(Siga公司);RPI1640干粉(GIB);小牛血清(四季青生物工程材料);噻唑蓝(TT)(Siga公司)

8、;青霉素(北京鼎国生物技术开展中心);链霉素(北京鼎国生物技术开展中心);二甲基亚砜(DS)(Siga公司);高效液相色谱分析仪(HPL)(美国Agilent公司);荧光显微镜(LEia);DYY-6型电泳仪(北京六一仪器厂);微波炉(广东顺德);del550酶标仪(BI-RAD美国);凝胶成像系统(Tu-20，美国)。2方法2.1高效液相色谱法测定绿茶中EGG含量2.1.1高效液相色谱条件色谱柱为18，监测器：紫外监测波长(280n);流动相为双重蒸水/乙腈/乙酸乙酯(86122V/V/V)，流速：1.0l/in。2.1.2标准曲线的绘制准确称取EGG0.0100g，用双蒸水溶解于10l容量

9、瓶中，经微孔滤膜过滤作为母液，通过梯度稀释得到终浓度为(0.0050，0.0025，0.0013，0.0006，0.0003)g/l的EGG待测溶液。2.1.3样品中EGG含量的测定准确称取绿茶提取物0.0100g，用双蒸水溶于10l容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为待测样品。2.2细胞培养及TT法检测细胞增殖情况BG823细胞株购自山东省医学科学院，置于含10%胎牛血清的RPI-1640培养体系中，在37，50l/L2的饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的胃癌细胞BG823以5107/L浓度接种于96孔培养板,每孔100l,37,50l/L2培养箱中培养。24h后分别接入不同浓度的无菌EGG溶液1

10、00l,使最终浓度分别为510-3,110-2,210-2,410-2g/L,各组设8个重复孔,对照组加100l培养液,在37,50l/L2条件下继续培养48h。实验终止前参加新配制的5g/L的TT溶液20l,混匀,再继续培养4h.弃去上清液,每孔加DS200l,充分振荡30in,溶解TT沉淀物,490n测定每孔的吸光度A值。计算抑制率:抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)100%。2.3DNA梯度检测细胞凋亡将1108/L细胞接种于9个6培养皿中,24h后参加无菌EGG溶液,使每3皿终浓度为210-2,310-2，410-2g/L,对照组加等量的培养液。继续培养48h,0.25%胰蛋

11、白酶消化，1000r/in离心5in，细胞用1l冰冷的PBS重悬，1000r/in离心5in，弃上清液，重复1次，细胞按以下步骤抽提DNA：加消化缓冲液1l，再参加蛋白酶K(20g/l)15l在55消化3h。11酚/氯仿抽提，离心7000r/in，15in。再用氯仿抽提一次(注意操作动作要轻)。取上清(不要搅动液面)，移入干净EP管中。参加0.1体积的NaA，(pH5.2，5l/L),再参加2倍体积无水乙醇，小心混匀，-20过夜沉淀DNA，12000r/in离心5in。用70%乙醇洗涤2次，12000r/in离心5in，倒净EP管中乙醇，待乙醇痕量挥发，参加50l双蒸水溶解。2%琼脂糖凝胶电泳

12、检测细胞凋亡梯度。2.4统计学处理用SPSS12.0统计学软件和t-test处理数据，所有数据均用s表示。3结果3.1RP-HPL法测定绿茶提取物中EGG含量3.1.1EGG的高效液相色谱图谱见图1。图1标准品EGG的高效液相色谱图谱由图1确定EGG在实验色谱条件下的保存时间约为9.097in。3.1.2标准曲线的绘制检测各个浓度的EGG的峰面积，每个浓度重复3次，得回归方程为Y=21222X-688.27Y为峰面积，X为EGG浓度(0.35.0g/l)，R2=0.9965。3.1.3样品中EGG含量的测定通过与标准品出峰时间比照，可知出峰时间为9.056in的峰为EGG。重复3次5g/l样品

13、的高效液相色谱，得样品EGG峰面积平均值为8766.1，由标准曲线计算可知5g样品中EGG含量为0.45g，即绿茶提取物中EGG含量为9%。3.2TT法检测细胞增殖情况EGG对胃癌细胞BG823的生长有很强的抑制作用，而且呈现明显的剂量依赖性。见图2。转贴于论文联盟.ll.图2EGG对胃癌细胞BG823的生长抑制作用3.3DNA梯度检测细胞凋亡凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活,其DNA在核小体之间的连接处被切断,降解为180200bp的或其整倍数的寡核苷酸片段,经琼脂糖凝胶电泳呈现阶梯状条带(DNAladder)。(210-2,310-2，410-2)g/LEGG作用于胃癌细胞后,采用琼脂糖

14、凝胶电泳和溴化乙锭染色,可见明显的DNAladder凋亡带,对照组细胞那么无此凋亡梯状条带。见图3。4讨论胃癌是我国常见的肿瘤之一,为全部恶性肿瘤的第3位,占消化道肿瘤的首位。胃癌的死亡率相当高,是各种恶性肿瘤中的第1位。虽然近年来胃癌在我国的发病率有降低趋势,但作为重大疾病,胃癌的防治形势照旧非常严峻,亟待开掘新的有效的治疗策略。绿茶是三大茶系之一,绿茶多酚占绿茶干重的30%,大多数是儿茶素。许多流行病学研究都说明饮用绿茶同众多部位发生肿瘤的危险度偏低相关,尤其是胃、食管、卵巢和乳腺等6，7。实验采用反相高效液相色谱法测定日照绿茶提取物中EGG含量，确定其中含有EGG且含量为9%，观察EGG

15、对人胃癌细胞BG823的生长抑制作用，发现EGG可以通过诱导细胞凋亡抑制其生长和增殖。体内实验也显示,服用绿茶提取物或茶多酚能抑制裸鼠的乳腺癌和前列腺癌的生长8，9。流行病学及体内外实验研究结果相辅相成地提示我们绿茶对胃癌治疗可能有一定的疗效。因绿茶饮用在亚洲较为盛行,利用绿茶或绿茶成分预防和治疗肿瘤极具前景。EGG作为绿茶中的主要作用成分，是多效的生物活性物质，具有较强的抗肿瘤作用。它可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性及抑制生长因子介导的细胞分裂素活化蛋白激酶(APK)依赖性和酪氨酸激酶依赖性信号转导通路等发挥其作用1013。EGG用于药用具有毒性小，价格低廉，药源充足等优势，很有开发

16、前景。将来研究方向可着眼于：确定其特异性的靶向分子，进步其体内的新陈代谢及生物利用度，开展同其他抗肿瘤抑制剂的协同作用，进步肿瘤防治和治疗的效率，减小其潜在的副作用等。【参考文献】1朱发伟.茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯的研究进展J.中草药，2022，36(8)：1271.2仉燕崃,李楠,韩国柱,等.表没食子儿茶素没食子酸酯的研究进展J.中草药，2022，37(2)：303.3SalaHazgui,ArnaudBnnet,BeatrieNarki-Raby,etal.Epigallatehin-3-gallate(EGG)inhibitstheigratrybehavirfturbrnhial

17、epithelialellsJ.RespiratryResearh,2022，9：33.4Susanarthy,Andreaaprali,SteveEnkeann,etal.GreenteaatehinssuppresstheDNAsynthesisarker7intheTRAPdelfprstateanerJ.lnl,2022,1(2):196.5林晓贞,梁钢,黎莉，等.EGG对两株耐药肿瘤细胞的细胞毒增敏作用及抑瘤作用研究J.中药药理与临床，2022，22(1)：30.6inZhang,.DAry，J.Hlanetal.Greenteaandthepreventinfbreastaner:

18、aasentrlstudyinSutheasthinaJ.aringenesis，2022，28：1074.7LarssnS,lkA.TeansuptinandvariananerRiskinaPpulatin-BasedhrtJ.ArhInterned，2022，165:2683.8StuartE,SandlynJ,RsengrenRJ.Rlefepigallatehingallate(EGG)inthetreatentfbreastandprstateanerJ.LifeSi,2022,79(25):2329.9ThangapazhaRL,SinghAK,SharaAetal.Greenteaplyphenlsanditsnstituentepigallatehingallateinhibits