抗体基础技术应用类免疫荧光专题

1、免疫荧光技术（Immunofluorescence免疫荧光技术（ImmunofluorescenceIF）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术IF-利用细胞爬片的方法进行细胞水平的荧IF-利用石蜡包埋组织切片进行的IF-利用冷冻切片进行的 免疫学的基本反应是抗原-抗体反 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中，就可以。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标 直接 间接如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原抗体抗体

2、复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同（一）样品准用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，（一）样品准用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，作引起细胞脱落。进行免疫荧光观察，对于组织切片，样品准备与IHC相同IF- 样 细胞需要提前IF- 样 细胞需要提前在多孔培养板中的载玻片或盖玻片上培 （PBS配制用 石蜡包埋切片(IF-注意：在此操作过程中，一定石蜡包埋切片(IF-注意：在此操作过程中，一定不要让片子干燥 脱石蜡/水化二甲苯，5分钟，3100%，10分钟，3

3、dH2O 5分钟，2抗原修复（使用CST抗体说明书的抗原修复液 ForCitrate:Bringslidestoaboilin10mMsodiumcitrateHthen maainatasub-boilingtemperaturefor10minutes.Coolslideson bench top for 30 minutes.ForEDTA:Bringslidestoaboilin1mMEDTApH8.0followedbyminutesatasub-boilingtemperature.Nocoolingis冰冻切片(IF-冰冻切片(IF- 用PBS配置的2- 注意 室温下，固定15分

4、钟（二）除研究细胞表面抗（二）除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均防止细胞从玻片上脱落使标本易于保存 标本的固定原则是不能损伤细胞内的抗原不能凝集蛋白质应保持细胞和亚细胞结构产生一种抗原相互连接的网络结构。及戊二醛等进行固定产生一种抗原相互连接的网络结构。及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原用、通透处去通透处去的通透剂是去垢剂，如Triton,NP-40,以及T n20,Saponin,Digitonin（三）封 封闭的目的是为了减少抗体的非特（三）封 封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5,的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS羊混匀。边搅拌边加入LTritonX-100(100%)（四）抗体孵（四）抗体孵双重免疫荧光标记染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling 双重免疫荧光标记染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling 直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如和 2013 Cell Signaling Technology, 酸酸 PE：吸收光490560nm，发射光595nm，红色荧 AlexaF