疟疾检验技术精品课件

1、疟疾检验技术第1页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微镜检查显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准实验室技术第2页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六厚薄血膜的制作 血片制作在制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址第3页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒

2、针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。第4页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).第5页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六正确的推片姿势第6页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六标准的疟疾厚薄血膜片位置第7页，

3、共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片门诊发热病人血片居民普查血片第8页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六厚薄血膜的标准 厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列第9页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六血片染色 两种染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法 常用吉氏染色法第10页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六吉氏染液(原液)的配置 吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (纯) 250ml 甲醇 (纯) 250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨

4、, 然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于5个小时第11页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六稀释吉氏原液原液需经pH7.0盐酸缓冲液（PBS）或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。 吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.第12页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六操作1 （快染） 配制5%染液，（每张血片约需染

5、液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作2 (慢染) 在染色量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。吉氏染液浓度门诊染色第13页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）

6、插于晾干板上晾干，包装，镜检。 成批血片染色第14页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六质量好的染色 : 核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片第15页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六染色过程将血片平置于染色板上。用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血膜上，染色10 min。用清水细缓冲去染液。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜。第16页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六血片制作与染色注意事项 使用前载玻片一定要清洁，不然会影响 血片制作和镜检结果 厚血膜

7、干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果 配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量 固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜 冲洗染液时，不要冲走厚血膜。第17页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六原虫密度计算估计疟原虫感染程度有三种方法：半定量计数法 检查厚血膜白细胞原虫密度计数法检查厚血膜红细胞感染率计算法检查薄血膜第18页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟

8、原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野15个虫，记录“”4.平均每个视野610个虫，记录“+”5. 平均每个视野11100个虫，记录“+ ”6. 平均每个视野100个虫以上，记录“+ ”。半定量计数法第19页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）白细胞疟原虫密度计数法重要性 用于疟疾研究 用于临床诊断 用于抗疟后疟疾考核第20页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），

9、如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 患者每微升血的白细胞数 计数的白细胞数 = 疟原虫数/l血。 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白细胞计数(国际标准) 。白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）第21页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六白细胞疟原虫计数法举例假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细 胞为数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（原虫数）x 8000200（白细胞数） =1400 / l答：该患者原虫密度为1400 / l。第22

10、页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。红细胞感染率计算法（薄血膜）第23页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六1. 按以下公式计算： 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 X 100 计数的红细胞数2. 显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（ 300-500红细胞/视野）3. 按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟原虫数4. 如果

11、能见到疟原虫，但是记数500010000个红细胞时却没有感染红细胞，那么设定感染率为 红细胞感染率计算法（薄血膜）第24页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六如何确定疟原虫血片为阴性 检查全部厚血膜未查见疟原虫 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫第25页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六人类四种疟原虫的 基 本特征第26页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六感染人的疟原虫有四种: 恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale 第27页，共56

12、页，2022年，5月20日，0点48分，星期六恶性疟 P.falciparum 四种疟原虫中致病力最强 无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治 疗可危及生命 在我国主要流行云南省和海南省 第28页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六间日疟 P.vivax 间日疟原虫分布于我国大部分地区， 主要是中部地区 引起间日疟, 病程呈良性, 但有复发 第29页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六三日疟 P.malariae 三日疟在我国已基本消灭主要发生在晚秋及初冬, 无复发 卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫, 在我国已基本消灭引起症状与间日疟相似, 但很少复发第

13、30页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六 四种疟原虫的 诊断要点 第31页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六环状体钎细, 红细胞不涨大一个红细胞内可有几个环状体 环状体内可有2个核 环状体可贴在红细胞边缘 血片中没有其他发育期滋养体 配子体呈新月形或腊肠形 可出现茂氏点恶性疟（P.falciparum）鉴定 要点第32页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六红细胞通常涨大 薛氏点明显 成熟环状体粗大滋养体有阿米巴样伪足可见不同发育期的原虫 间日疟（P. vivax ）鉴定要点第33页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六环

14、状体可呈方形带状形是特点 成熟滋养体呈菊花状,内含612个裂殖子 红细胞不涨大，略缩小有时有西门氏点 三日疟（P.malariae）诊断要点第34页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六卵形疟（P. ovale）诊断要点红细胞略涨大或不变大 红细胞边缘呈车轮状环状体有时呈现鱼眼状薛氏点明显 成熟滋养体类似三日疟原虫,但更粗大原虫呈卵圆形 第35页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六 薄血膜中疟原虫寄生时 红细胞的变化间日疟原虫三日疟原虫恶性疟原虫卵形疟原虫涨大,色浅淡,略变形 可见薛氏点(除早期环状体时) 多重感染少见 疟色素黄褐色,散在,呈小杆状正常,或略小

15、 正常染色时点彩不明显多重感染少见 色素见于早期 ,黑色颗粒状,多见于细胞周围正常大小 常见多重感染 一些细胞呈黄色边缘较厚 过度染色时茂氏点明显 疟色素颗粒较粗 新月形配子体外红细胞膜见不到感染红细胞略涨大或不变大 通常呈卵圆形 感染红细胞边缘破碎状 薛氏点明显疟色素棕黄色,类似间日疟原虫第36页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六种周围血中发育阶段红细胞形态疟原虫形态大小点彩胞浆疟色素裂殖子数恶性疟原虫环状体配子体正常常见茂氏点环状体钎细，常见个核粗黑，配子体中明显16-32间日疟原虫各期滋养体裂殖体和配子体涨大,可达正常的 1.5-2 倍薛氏点可出现阿米巴样滋养体，浅蓝

16、色，活泼金棕色不明显12-24卵形疟原虫各期滋养体裂殖体涨大,可达正常的 1.25-1.5倍薛氏点可出现卵圆形滋养体，蓝色较深，核较大深棕色明显4-12三日疟原虫各期滋养体裂殖体和配子体正常西门氏点少见圆形，蓝色深，核紧缩，滋养体带状深棕色，粗明显6-12呈菊花状第37页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六镜检示教以下血片采自现症病例第38页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六This is a thin film from a 27 year old female backpacker, with a recent history of trekking

17、through Northern Thailand and high fever. A typical Plasmodium falciparum presentation.Numerous fine ring forms Double chromatin dots Marginal forms Red cells are not enlarged第39页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六A thin film from a 22 year old male holidaying in Lombok (Indonesia) one month previously. Int

18、ermittent fevers since returning. A typical Plasmodium vivax presentationSalient features are: Developing and thick (signet) ring forms Enlarged red cells 第40页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六Recent travel in Africa. Pyrexia of unknown origin. A typical Plasmodium ovale presentationDeveloping form of plas

19、modium Comet-like red cells Enlarged red cell 第41页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六Female patient, arrived from Brazil two weeks previously. Flu like symptoms since arrival. A typical Plasmodium malariae presentationBroad band form of plasmodium Red cells not enlarged第42页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六This is

20、 a thick film prepared from a 32 year old male recently returned from Vietnam. Numerous ring form of Plasmodium can be seen (as indicated by the arrows). Note size of neutrophils (for comparison).The only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present. Thin films wou

21、ld have to be examined for species identification.第43页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六读片练习第44页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 第45页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. 第46页

22、，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C 第47页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六5. Male recently returned to Australia after backpacking through Asia. History of flu like symptoms. 第48页，共56页，2022年，5月20日，0点48分，星期六6. New Australian previously from Malaysia. Intermittent temperatures and head