多糖的分离纯化及分析

1、.多糖的分离纯化及分析一、多糖的提取方法（一）溶剂提取法1、水提法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，积分数达到 70%室温静置 5h，多糖的质量分数和得率均较高.2、酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。有些多糖在碱液中有碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。3、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术.（二）生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维

2、素酶，果胶酶等。（三）超声提取法或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。（四）微波提取微波是频率介于 300MHz 和 300GHz 之间的非电离电磁波，微波提取的原理细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。二、多糖的分离纯化（一）多糖的分离的可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等，也可按分子所带基团的性质分级1、按溶解性不同分离（1）分步沉淀法分

3、步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀（2）盐析法盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，其中以硫酸铵最佳。.2 、按电离性质不同分离季胺盐沉淀法季胺氢氧化物是一类乳化剂，能与酸性多糖形成不溶性化合物季铵络合物，此络合物在低离子强度的水溶液中不溶解而产生沉淀。若提高多糖液pH值或加的溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。3 、柱层析法（1）凝胶柱层析法凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和

4、缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。（2）纤维素阴离子交换剂柱层析法纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为DEAE一纤维素和ECTEOLA一纤维素，分类硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙参多糖、太子参多糖等。（3）活性炭柱层析法脱无机盐、单糖等再依次增加乙醇浓度进行洗脱。（4）离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法有些植物的多糖成分复杂， 除中性多糖外，还含有糖醛酸等，因此往往两种不同性质的色谱柱联用才能得到单一多糖组分。（5）三种层析柱联

5、用采用离子交换葡聚糖凝胶柱、丙烯葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用，即先进行 DEAESephadexA 柱层析，用蒸馏水洗脱。水洗组分进一步用SephacrylS SephadexG 一 100 的得率。4、色谱分离法常用两种色谱分离方法：一是凝胶柱色谱法，二是离子交换色谱法.5、膜分离法膜分离技术（MST）是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分料液中组分有选择性的通过膜.目前应用较多的是超滤和微滤技术.（二）多糖的纯化1如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=41）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有较好效果但要达到除尽游离蛋白

6、质的目的仍需反复处理。冻融和等电点沉淀除蛋白质操作简单，但多糖液里往往有低浓度的蛋白质残留，应与其它方法结合使用。2、 纤(DEAE 一纤维素(H2O2)等脱除。01左右的活性炭，煮沸后滤过即完成了脱色操作。.3、除小分子杂质：小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性，需要进一步脱除，提高纯度。传统的方法是透析法，该法操作简单、技术成熟， 2 一 3 的分子分级，这种方式可缩短生产周期，而且条件温和。三、多糖的分析鉴定1、含量的测定测定方法：硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe法、薄层色谱法、酶法、原子吸收法、HPLC法、凝胶电泳法、亲和

7、电泳法等.每种方法只对某些多糖的测量效果好.比色法、分光光度法、离子交换色谱法、酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析.2、纯度鉴定上是一定分子量范围的均一组分.多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC 法等.现在应用较多的是 HLPC 法，旋光度测定也是纯度测定的一种方法.3、分子量的测定多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作.常用方法：渗透压法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC 法、MALDITOFMS 法.4、结构测定（1）多糖一级结构测定苷建构型.常用化学法和仪器分析法.多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析.仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法.（2）多糖高级结构测定目前研究多糖的二级