蛋白表达系统概述

1、蛋白表达体系概述 目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线基因载体目的基因 质粒 噬菌体 病毒 PCR cDNA 人工合成 基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶 重组体 转化 转染 体外包装带重组体的宿主细胞 表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法目的基因的表达表达体系的发展 表达体 载体 宿主第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞第四代 基因直接导入 DNA本身 生殖细胞、 体细胞、个体原核表达载必备的组成有抗菌素抗性基因决定载体拷贝数的复制起点 (ori )供外源基因插

2、入的多克隆位点参与控制转录与翻译的必不可少的原件另注：外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构必须是连续的 , 不间断的 , 处于寄主启动子有效控制下。核糖体结合位点启动子转录终止子复制起点质粒型表达载体病毒型表达载体真核生物细胞常用的表达载体腺病毒表达载体逆转录病毒表达载体昆虫杆状病毒表达载体细菌表达系统特殊的表达用菌株BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB(DE3) : thioredox

3、in reductase（硫氧还蛋白还原酶）突变 thioredoxin reductase/glutathione reductase （硫氧还蛋白还原酶/谷胱甘肽还原酶）双突变 适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达酵母表达体系优点：可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;缺点：糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce c

4、erevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）酵母表达系统昆虫表达体系可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰糖链有所区别，表达量有限作为药物宿主细胞未被FDA认可昆虫表达系统（Bac-N-blu体系）昆虫表达系统（Bac-to-Bac体系）哺乳动物细胞表达体系可进行分泌表达，有天然立体结构加糖方式与人体蛋白质完全一致表达量不够高，培养成本较高动物乳腺组织表达分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质 至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产转基因动物制作花费巨大，实验周期长用显微注射法产生转基因小鼠利用转基因羊在乳汁中生产重要的转基因蛋白表达系统的选择研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞多