氨基酸的分离鉴定-纸层析法

1、氨基酸的分离鉴定纸层析法化学与生物工程学院生物工程系生物化学实验报告课程名称：生物化学实验项目：氨基酸的分离鉴定纸层析法实验室名：生物化学实验室实验时间：2012-11-15任课老师：杨艳专业班级：生物工程1142学生姓名：髙晔学 号：201121030219组别：第五组【实验器材】器材层析缸、毛细管、小烧杯 、量筒、培养皿 、分液漏斗、层析滤纸 (新华一号 )、喷雾器（或白瓷盘），烘箱（或吹风机）、铅笔、直尺试剂1)、扩展剂40mL将 20 mL 水饱和的正丁醇和 5 mL 醋酸以体积比4：1 在分液漏斗中进行混合。然后与15mL 蒸馏水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩

2、展剂约 5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。2)、氨基酸溶液 05的赖氨酸、 脯氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 (各组份浓度均为 05 )各配置 5mL 。3)、显色剂 50100mL 01水合茚三酮正丁醇溶液。【实验步骤】1）检查培养皿是否干燥、 洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内 120烘干。2）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约 5mL 展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡 20min 。3）规划：带上手套，取宽约 10cm、高约 15cm 的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘 23 cm处轻轻用

3、铅笔划一条平行于底边的直线 A ，在直线上做 4 个记号，记号之间间隔 2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘 1cm 处画一条平行于左边缘的直线 B，在 B 线上以 A、B 两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位） ，参见下图。图 2 实验装置示意图4） 点样：用毛细管分别取 10mL 左右的氨基酸样品点在四个位置上。干后重复点样，同一位置上需点 23 次， 23mL/ 次，保证每点在纸上扩散的直径最大不超过 3mm 。其中 3 个是已知样， 1 个是待测样品。5） 层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行，参见图 1-1。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm

4、左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在 A 线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到 A 线时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度，填入表 1 中。当上升到 15 18cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，自然风干或用电吹风热风吹干。6） 显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上 0.1% 茚三酮正丁醇溶液， 然后置烘箱中烘烤 5 分钟 (100)或用热风吹干即可显出各层析斑点。7） 计算各种氨基酸的 Rf 值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表2。8） 以层析时间为横坐标，扩展剂上

5、升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到 15cm 时所需要的时间。【实验结果与数据处理】X表 1扩展剂前沿上升速度0510 15 20 30 40 6090 （min）Y0.1.2.3.4.5.7.8.1（cm08515 75 859988. 5）表 2 各种氨基酸的 Rf 值赖氨 脯氨亮氨 待测酸酸酸氨基0.10.430.7酸原点到层析斑点中100.44心的距离0.80.880.80.88原点到溶剂前沿的88距离0.10.480.70.50Rf29判断待测氨基酸赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸【实验结论】通过实验可以知道每种氨基酸的在扩展剂中的移动速率是不相同的，利用每种氨基酸在纸上的位置不同可以计算出

6、氨基酸的Rf 值。和标准的 Rf 值对比，得出氨基酸种类。据此由上表 2 可知，混合氨基酸是由赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸组成。【注意事项 】.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面 (即展层时样品可能达到的部分 )。.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性 (斑点发黄 )。.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的 Rf 值十分接近时， 单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转 90 度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱